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时间相关单光子计数(TCSPC)技术原理及应用,信息工程学院主讲人：Alen Fielding,目录,1 时间相关单光子计数（TCSPC）技术简介2 光子计数技术3 单光子计数器框图4 TCSPC 实验方框图5 TCSPC 经典工作方式和原理图6 时间相关单光子计数技术的应用,时间相关单光子计数（TCSPC）技术简介,时间相关单光子计数技术首先由 Bollinger、Bennett、Koechlin 三人在六十年代为检测被射线激发的闪烁体发光而建立的,后来人们把它应用到荧光寿命的测量。它的优点如下：时间分辨本领好,灵敏度高,测量精度高,动态范围大,输出数据数字化,便于计算机存贮和处理等。在近代物理、化学、生物等领域中获得了广泛的应用,特别是在研究发光动力学方面更有它特殊用途.,光子计数技术,光子计数技术也就是光电子计数，是一种计量离散的光子脉冲的数字技术。它所探测光电流强度比光电检测器本身在室温下的热噪声水平（10-14W）还要低，用通常的直流检测方法是不能把这种湮没在噪声中的信号提取出来。光子计数方法利用弱光照射下光子探测器输出电信号自然离散的特点，采用脉冲甄别技术和数字计数技术把极其弱的信号识别并提取出来。,光电倍增管（PMT）在不同光输入时的输出 1,(a)输入光较强时PMT输出有涨落的直流量。(b)输入光较弱时PMT输出光电流不再是连续的。(c)输入光极弱时PMT输出离散的脉冲。,单光子计数器框图1,TCSPC 实验方框图3,纳秒闸控放电灯,激光单色仪,样品,放大器,显示器,光电倍增管,多通道分析仪,光电倍增管,荧光单色仪,放大器,甄别器,延时器,计算机,甄别器,A/D,TCSPC 经典工作方式1,TCSPC原理及原理图2,基本原理：用一个窄光脉冲激发样品,然后检测样品所发射的第一个荧光光子到达光信号接收器的时间。由TAC将此时间成比例的转化为相应的电压脉冲，再将此电脉冲通过AD转换通入多通道分析器3，在多通道分析器中,这些输出脉冲均依次送人各通道中累加贮存。就获得了与原始波形一致的直方图。在某一时间间隔内检测到光子的几率与荧光发射强度成正比例,重复多次测量得到荧光强度衰变的规律。,时间相关单光子计数技术的应用,荧光寿命实验扩散光学层析其他应用,荧光寿命实验,什么是荧光？什么是荧光寿命？研究荧光寿命有什么意义？如何测量荧光寿命？有什么应用？,什么是荧光？什么是荧光寿命？,当某种物质被一束激光激发后,该物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上,再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态.当激发停止后,分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间称为荧光寿命，它表示粒子在激发态存在的平均时间,通常称为激发态的荧光寿命。,研究荧光寿命有什么意义？,荧光物质的荧光寿命不仅与自身的结构而且与其所处微环境的极性、粘度等条件有关，因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体系发生的变化。荧光现象多发生在纳秒级，这正好是分子运动所发生的时间尺度，因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程，例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等4。,如何测量荧光寿命？,时间相关单光子法调相法闪频法,有单色仪的荧光寿命光谱仪,计算方法5,处于激发态的荧光分子在退激发到基态的过程中发射荧光释放能量，激发态荧光团荧光强度的衰减用数学式表达为单指数函数：,荧光寿命原理图,多光谱荧光寿命实验2,通常情况下为了避免光漂白效应，总的激光剂量不可能太大，而且研究对象的荧光也可能发生动态变化，此外，作为一种检测、诊断或治疗手法应用到病人身上，激光功率还受到激光安全方面的限制。因此用单色仪进行扫描获得时间分辨荧光常常是不太可取的方法，此时要记录多个波段的衰减曲线。,双色分光镜多波长探测侧系统,多波长荧光实验,对若丹明6G和荧光素的混合物，同时记录得到的荧光强度随时间和波长变化的曲线,时间相关单光子技术测荧光寿命的优缺点,优点：在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差小，是目前最流行的荧光寿命测定方法。缺点：但是这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢，无法满足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。,应用,由于荧光分子与溶剂的相互作用、构象变化以及与蛋白、缩氨酸和脂质等的不同结合状态而引起的荧光寿命变化。荧光分子的寿命随其周围环境的折射率而变化。压力对荧光寿命的影响在。电子和质子传递与荧光寿命的关系。光动力学治疗的相关研究.金属纳米颗粒结合后，荧光染料的辐射衰减速率和光稳定性得到增强。,扩散光学层析成像（DOT）,什么是扩散光学层析成像？基本原理是什么？主要应用有那些？优点,什么是扩散光学层析成像,扩散光学层析成(DiffuseOpticalTomography,DOT)就是利用光与生物组织生理指标密切而灵敏的联系,通过对组织体穿透能力较强的近红外光照射组织体,由光电探测阵列采集漫射(扩散)光并取相关算法反推光学参数空间分布进而反映关联生理变化。,基本原理,光子入射到生物组织中，其经历伴随有反射、吸收、散射和透射等过程。光子在组织中的传输大多是基于传输理论。在传输理论中，主要采用吸收系数、散射系数、各向异性因子等来描述组织的光学特性。这些组织光学特性参数是激光诊断、激光治疗、光剂量学等理论和临床实践的基础。,如何获得光学特性？,红外线,组织体,扩散光,光学参数,光学特性,如何?,什么样的？,各种组织成分的吸收光谱,从图中可以看到大约在650-900nm有一个吸收窗口，在这个波段内对光的吸收很少，因此，可以对组织用近红外进行照射，此时可以光子可以透过组织并探测到。,其中：a是散射系数,g是向异性因子,s是约化散射系数eff是衰减系数，I0是初始光源强度，R漫射(反射)光强度，光源到探测器距离，zo，zb，eff，rl，r2都是a，s的函数。,扩散光扩散方程7,相对均匀的组织s可视为常数2,a,光学特性,时间相关单光子计数,R,主要应用,乳房层析成像 例：乳腺癌检测8脑成像 例：早产儿血样动力变化成像9肌肉与骨骼的研究 例：骨骼的光学实验，肌肉组织中的血流动力学和氧动力学的检测（例：心肌细胞动力研究10）,乳房层析照相原理图,左图：X光照片 右图光学照片,脑成像原理图,优点,测量结果受光电探测器的漂移、系统增益变化以及其他不稳定因素的影响较小。消除了大部分探测器热噪声的影响，提高了测量结果的信噪比。有比较宽的线性动态区在乳腺检查方面与现有的X-CT、磁共振成像(MRI)等相比,DOT系统具有无损、低价、功能成像等。,3.其他应用,1.光谱仪 成果：亚纳秒荧光测量系统（中国科学院长春光学机械与物理研究所2004）皮秒时间相关单光子计数光谱仪研制（中国科学院长春光学机械与物理研究所2003）应用：广泛应用于冶金、铸造、机械、金属加工、汽车制造、有色、航空航天、兵器、化工等领域的生产过程控制，中心实验室成品检验等，可用于Fe、Al、Cu、Ni、Co、Mg、Ti、Zn、Pb等多种金属及其合金样品分析。可对片状、块状以及棒状的固体样品中的非金属元素（C、P、S、B等）以及金属元素进行准确定量分析。,2.窄脉冲激光在GI-POF光纤中的特性测量3.全数字高精度激光测距系统的设计与实现4.激光扫描显微技术,参考文献：1王静怡.多通道时间相关单光子计数DOT/FMT系统集成和操作平台开发D.2009.2 W.Becker.Advanced Time-Correlated Single Photon Counting TechniquesM.(2009)3 W.Becker,A.Bergmann,C.Biskup,T.Zimmer,N.Klker,K.Benndorf,Multiwavelength TCSPC lifetime imaging,Proc.SPIE 4,620 7984(2002)4房喻.荧光寿命测定的现代方法与应用J.化学通报,2001,64(10)5刘立新,屈军乐,林子扬等.荧光寿命成像及其在生物医学中的应用J.深圳大学学报（理工版）,2005,22(2)6张丽敏.时域荧光扩散光层析的基本理论与实验研究D.2009.,7覃东利.时间分辨组织体光学参数测量及扩散光学成像实验研究D.2007.8刘维.用于乳腺扩散光学层析成像的多通道光子计数系统的设计D.2007.9高峰,杨芳,和慧园.早产儿大脑血氧动力变化的二维扩散光学层析技术A.2007年中国科学技术协会年会论文集C.2007.10程颖,任明明,Poirier N等.心肌细胞NAD(P)H荧光成分分析法监测心脏移植排斥反应J.中国胸心血管外科临床杂志,2009,16(6),谢谢,
