有机高分子基质的HPLC填料.ppt
第十章 有机高分子基质的高效液相色谱分离柱填料,补充内容：高效液相色谱,HPLC方法的主要特点有那些？HPLC的主要设备分哪几部分？,1、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,2、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别,3操作条件GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大）,4.HPLC方法的主要特点,分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂化合物的分离应用范围广：无机物有机物，天然物质合成产物，小分子-大分子，一般化合物到生物活性物质分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作参数选择广泛分离纯化+分析检测样品量从痕量到大规模制备，实现在线监测和自动化操作。,5.高效液相色谱仪,一、液体输送系统二、梯度洗脱装置三、进样系统四、馏分收集器五、检测系统六、色谱分离系统,一、液体输送系统高压输液泵,用于输送流动相，由于色谱柱很细、为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m）、流动液的扩散系数远小于气体，故液体的流动相高速通过时，液体流动时阻力很大，必须要有很高的柱前压力。压力：150350105 Pa，高压、高速是高效液相色谱的特点之一。流量稳定（影响重现性及分析精度）、流速可调 应具有压力平稳、脉冲小、耐腐蚀等特性,高压泵按其性质可分为恒流泵、恒压泵两类,恒流泵柱塞往复泵,二、梯度淋洗装置 gradient elution,又称梯度洗提、梯度洗脱，与气相色谱中的程序升温一样，可极大地改善分离效果载液中含有两种及以上的不同极性（或不同性质）的溶剂，在分离过程中按照一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素。通过梯度洗脱，可缩短分离时间、提高分辨能力、改善峰形，还可提高分析精度。,二、梯度洗脱装置,外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵，通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,高压定量进样阀：流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：优点：进样准确，重现性好，适于定量分析6_Port_Injector,注射器进样装置：微量进样器刺过装有弹性隔膜的进样器，针尖直达固定相上端。缺点：不能承受高压，须停流进样；无法取得精确的保留时间，能耐各种溶剂的橡皮不易找到,三、进样装置,四、馏分收集器,HPLC：柱后流出物中被分离组分在室温下都以溶液形式存在，溶剂挥发后可得到纯组分收集纯馏分做进一步鉴定、考察；或者是为了获得足够量的纯产品,自动馏分收集器,五、检测系统,1、紫外检测器:应用最广，对大部分有机化合物有响应。作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律特点：灵敏度高；线形范围高；波长可选，易于操作；对流动相的流速和温度变化不敏感；应用可变波长检测器，以选择最佳检测波长。,2、示差折光检测器（differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低（10-7g/ml）对温度敏感不能用于梯度洗脱why？（凝胶渗透色谱中最为常用）,3、荧光检测器（fluorescence detector）,受紫外光激发后能够辐射出比紫外光波长较长的光高灵敏度(比紫外检测器高两个数量级，达10-11 g/ml)、高选择性；对多环芳烃，维生素B黄曲霉素、卟啉类化合物农药、药物、氨基酸甾类化合物等有响应；,4、电导检测器（electrical conductivity detector）,属电化学检测器，是离子色谱法中应用最为广泛的检测器作用原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质的含量。,受温度影响较大，须严格控制温度化学抑制型离子色谱体系中可直接检测,5、蒸发光散射检测器（Evaportive Light Scattering Detector,ELSD）,（1）用惰性气体雾化脱洗液（2）流动相在加热管（漂移管）中蒸发（3）样品颗粒散射光，其散射光强度与样品质量呈正比。,ELSD最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物，其响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。广普型检测器，且可用于梯度洗脱高灵敏度高价位,六、色谱分离系统,高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。装柱方法：有干法和湿法两种，按粒度20m划分，湿法装柱又称匀浆法。,HPLC的关键设备,专用的高压输液系统;高灵敏检测系统;高效分离柱其中分离柱是色谱的中心,是最为关键的部分,HPLC操作过程演示,商品HPLC外观,6.高效液相色谱法的主要类型及其分离原理,(1)液-液分配色谱 liquid-liquid partition chromatography(2)液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography(3)离子对色谱 ion-pair chromatography(4)离子交换色谱 ion-exchange chromatography(5)离子色谱 ion chromatography(6)空间排阻色谱 steric exclusion chromatography,(1)离子色谱法（IC）,离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。使得离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。1975年Small等人通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。,(1)离子色谱法（IC）,若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：R+OHH+Cl-R+Cl十H2O R+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl-由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2.6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。,(1)离子色谱法（IC）,在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出不采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。,(2)离子对色谱法（IPC）,IPC是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。它是离子对萃取技术与色谱法相结合的产物。1离子对色谱法原理 离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。,(2)离子对色谱法（IPC）,2、离子对色谱法分离的基本原理A-水相+B+有机相 A-B+有机相由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同,KAB,(3)亲和色谱法（AC）,是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。,第二部分：HPLC分离填料,有机基质,多糖型凝胶,高聚物树脂,无机基质,硅胶,氧化锆,氧化铝,多孔玻璃,羟基磷灰石,石墨化碳黑,基质微球天然多糖或合成单体或交联剂负载样品的能力强，色谱容量高耐酸碱、具化学稳定性，柱寿命长，易再生不易产生非特异性吸附作用,一、HPLC色谱柱的关键在于填料,物理结构色谱动力学（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗粒强度和表观形态柱效率、穿透性）化学结构色谱热力学（连接在基质上的官能团或链段样品保留值、选择性）,1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求:颗粒大小合适，粒度分布较窄;颗粒强度适应高速高压操作;多孔型的孔径大小和孔径分布适宜,避免复杂的微孔结构;一定的溶胀及收缩水平。,常见的液相色谱填料类型,目前的主要发展方向(研究热点):颗粒单分散的填料;贯穿性超大孔结构的填料;小颗粒的非多孔填料。,2、HPLC色谱柱填料在化学结构上的要求特定的选择性;良好的化学稳定性及热稳定性;避免不可逆吸附。不同填料的化学结构是通过对基质材料的化学改性而实现的。,离子交换色谱填料 颗粒表面携带季铵基、DEAE基、磺酸基、羧基等强弱阴阳离子集团。反相色谱填料 C18、C8烷基等强疏水性集团正相色谱填料 羟基、氨基、氰基等极性集团亲和色谱填料 蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异性的配基,二、有机高分子类型的HPLC填料基质树脂,基质材料决定填料物理结构和化学结构:颗粒大小与分布,颗粒强度,孔径大小,孔结构形态,颗粒内部的化学结构及其稳定性,直接影响对颗粒的表面(包括内孔表面)的化学修饰。可分为:多糖型聚合物型,（一）多糖型基质材料,1.葡聚糖系:高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好,粒度小而且分布范围窄（1023m）;Sephasorb HP Uitrafine 用于中低压色谱和高效色谱烯丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联共聚而成的凝胶。Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属于高效凝胶，较高流速下使用,2.琼脂糖系:Sepharose与2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝胶 Sepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)高度偶联琼脂糖凝胶Sepharose Fast Flow(Sepharose 6FF,Sepharose 4FF)高效琼脂糖凝胶Sepharose high PerformanceSuperdax(葡聚糖与交联琼脂糖的结合)：快流速Superose(珠状琼脂糖经两次交联)：高效凝胶,（二）聚合物型基质材料,交联聚苯乙烯树脂:苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)，是应用最为广泛的一类基质树脂。交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。,三、填料性能评价,填料的物化性质指标填料的色谱性能表征,1、物化性质指标:a.颗粒大小及其分布(dp);b.比表面积S(m2/g)；c.骨架密度g(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、溶胀因子f;d.比孔体积Vp(ml/g);e.孔度；f.孔径大小及分布；g.化学结构与化学性质。,2、色谱性能表征:保留值：保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K)选择性：相邻二物质保留时间之比,与固定相、流动相及温度有关。柱效率：理论塔板数(N)，或理论塔板高度(H)表示。填充柱的总空隙度和穿透性：分离度(R)：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰底宽度一半之和的比值。,四、反相HPLC高分子填料Reversed Phase Chromatography,RPC,反相色谱（原理参照P237）：非极性固定相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。,1.目前RPC分离柱以硅胶基质的键合相填料为主，特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。特点：传质快，刚性好，柱效高，选择性好。不足：pH28，容易使蛋白质失活（残留的硅羟基）,广泛使用的是微球形交联聚苯乙烯树脂，另有带C18烷基侧链的聚丙酰胺、聚甲基丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化物，C18烷基键合的聚乙烯醇。优点：pH范围较广，表面有较强的疏水性,主要厂家,日本：东洋-曹达Tosoh-TSK瑞士：Hamilton,汉密尔顿,英国：高聚物实验室Polymer Lab美国：Bio-Rad伯乐瑞典：安捷伦Agilent详见：P194表101,被分离样品的分子量大小与填料的孔径选择 如PLRPS填料：孔径10nm，适于分离1520个氨基酸长度的肽类；孔径30nm，适于分离中等分子量的球形蛋白质；孔径100nm，适于分离较大的球形蛋白质或纤维状结构的化合物；孔径400nm，适于分离很大分子量的蛋白质。,三氟乙酸(TFA),在IEC中,高分子类型填料表现更大的优越性。大致有3类：多糖基质的离子交换层析介质聚合物基质的高效离子交换色谱填料高聚物型离子交换色谱填料,五、离子交换HPLC填料Ion exchange chromatography IEC,1.多糖基质的离子交换层析介质传统的多糖类软质凝胶制得强弱阴阳离子交换介质：具有很好亲水性和生物相容性；高交联度多糖类凝胶填料：还适于较高压力和流速下操作。,2.聚合物基质的高效离子交换色谱填料交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯聚甲基丙烯酸酯;4-乙烯吡啶共聚物特点：高交联大孔结构,良好的刚性 和小而均匀的粒度,a.多孔树脂的IEC填料:柱效、穿透性、分离度、负载量、回收率的性能优异Mono Beads 系列：包括Mono Q,Mono S,Mono PSOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S贯流色谱填料POROS系列羟基化聚醚凝胶：如TSK gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW等交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯:亲水,大孔,b.非多孔树脂的IEC填料:羟基化聚醚,交联聚苯乙烯,交联聚甲基丙烯酸酯,交联琼脂糖等。优点:颗粒小,均匀,刚性好,色谱穿透性强,流速适应范围宽。避免了固相内的吸附与扩散，因此具有高柱效,高分离度和高样品回收率的特点。,c.薄壳型树脂的IEC填料:优点:柱效高,选择性好,分离度高,穿透性好,回收高,流速快等,有机高分子类型的疏水HPLC填料Hydrophobic interaction chromatography,HIC,HIC:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用。高浓度盐条件下,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能力下降。当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱。,常见淋洗液有(NH4)2SO4,NH4Ac,NaCl,磷酸盐等,其中(NH4)2SO4是最广泛应用的。与RPC比较在原理上的区别及其优缺点?,六、疏水色谱HPLC填料,一般是亲水性基质,或在合成的非亲水性基质上连接一定的亲水基团，然后引入疏水性基团,主要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。其基质可以是多糖类,也可以是各类高分子多聚物,包括交联聚苯乙烯树脂、硅胶、羟基化聚醚树脂、交联甲基丙烯酸酯类。HIC填料绝大多数是多孔结构,主要是超大孔结构，也可以是非多孔结构的。P206表10-4,七、有机高分子类型的空间排阻HPLC填料Size exclusion chromatography,SEC,SEC填料特征：填料的性质必须与溶质和淋洗体系相匹配,可以被淋洗剂所浸润；填料和试样尽可能不发生任何基团之间的相互作用,即尽可能避免非空间排阻效应；填料的多孔结构是SEC建立的基础；,SEC填料的色谱特征：除了柱效,选择性,分离度,穿透性等一般色谱表征外,尚需要满足以下指标：排阻极限;分离范围;固流相比,凝胶填料主要类型,多糖类传统的软质凝胶:葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰胺型凝胶高交联的多糖类凝胶:Superdex,Superose,Sephacryl,Sepharose CL高聚物型多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂,交联聚乙烯醇树脂,亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂,羟基化聚醚类.(表10-7 P213),凝胶渗透色谱Gel permeation chromatography,GPC,有机溶济为流动相THF四氢呋喃,有机高分子类型生物亲和HPLC填料Affinity chromatography,AFC,优点:高选择性,能有效保持生物分子的高级结构稳定性,活性样品的回收率。按其基质不同分:多糖型和高聚物型。按其所带配体对被分离物质的选择性特征可分为通用型和专用型。,
