生化chapter 0307 amino acids and proteins1.ppt

第三章氨基酸与蛋白质,教材 第3-7章What is the structure,chemistry,and biological function of amino acids，peptides，proteins?,概念分类功能,第一章氨基酸的结构和性质,1、一般结构,2、分类,常用方法：硫酸或盐酸处理 浓度:盐酸为6mol/L 硫酸为4mol/L 条件:回流煮沸20 h左右 优点:不引起消旋作用，得到L-氨基酸 缺点:色氨酸完全被沸酸所破坏 羟基氨基酸（丝,苏）部分被水解 天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来,（酸水解）,1.1 蛋白质的水解,常用方法：用氢氧化钠处理浓度:5mol/L条件:共煮1020 h优点:色氨酸稳定缺点:多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生 消旋现象；所得为D型和L型混合氨基酸；碱水解引起精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素,（碱水解）,1.1 蛋白质的水解,优点:不产生消旋作用，也不破坏氨基酸缺点:需要几种酶协同作用，酶水解所需时间较长,（酶水解）,1.1 蛋白质的水解,水解位点,R1：赖氨酸（Lys）精氨酸（Arg）特点：专一性较强，水解速度快,N,H,C,H,C,O,R,4,N,H,C,H,C,O,R,3,N,H,C,H,C,O,R,2,N,H,C,H,C,O,R,1,OH,（牛胰蛋白酶）,1.1 蛋白质的水解,N,H,C,H,C,O,R,4,N,H,C,H,C,O,R,3,N,H,C,H,C,O,R,2,N,H,C,H,C,O,R,1,水解位点,R1：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）酪氨酸(Tyr)亮氨酸(Leu)疏水氨基酸特点：水解稍慢,OH,糜蛋白酶,1.1 蛋白质的水解,N,H,C,H,C,O,R,4,N,H,C,H,C,O,R,3,N,H,C,H,C,O,R,2,N,H,C,H,C,O,R,1,水解位点,R1：苯丙氨酸(Phe)色氨酸(Trp）酪氨酸(Tyr)亮氨酸(Leu)R2:疏水氨基酸特点：水解速度较快，作用条件与糜蛋白酶不同,OH,胃蛋白酶,1.1 蛋白质的水解,1.2 蛋白质的基本结构单元,除了甘氨酸以外，组成蛋白质的所有氨基酸都有手性碳原子。,1.2 蛋白质的基本结构单元,组成蛋白质的氨基酸以肽键的形式链接在一起。,L氨基酸,D氨基酸,组成蛋白质的氨基酸大都为L型,氨基酸的构型,1.2 蛋白质的基本结构单元,2.1 氨基酸的分类（名称，缩写，结构式）,按侧链R基的化学结构特点 脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、杂环氨基酸 根据R基团的极性 非极性R基、极性R基氨基酸（不带电荷的、带正电荷的、带负电荷的）根据酸碱性质 酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸 按氨基酸是否能在人体内合成 必需氨基酸、半、非必需氨基酸,2.1 氨基酸的分类,2.1 氨基酸的分类,（其他教材，仅供参考）,一氨基一羧基氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸含羟基氨基酸有丝氨酸、苏氨酸含硫氨基酸有半胱氨酸、蛋氨酸（常称甲硫氨酸）一氨基二羧基氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸二氨基一羧基氨基酸有赖氨酸、精氨酸含酰胺基氨基酸有天冬酰胺、谷氨酰胺,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸3,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸4,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸5,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,含羟基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,含羟基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,含硫氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,2个半胱氨酸通过二硫键连接形成胱氨酸,含硫氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,含硫氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,一氨基二羧基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,一氨基二羧基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,二氨基一羧基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,二氨基一羧基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,含酰胺基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,含酰胺基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点-脂肪族氨基酸,芳香族氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-芳香族氨基酸,芳香族氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点-芳香族氨基酸,芳香族氨基酸3,（1）按侧链R基的化学结构特点-芳香族氨基酸,杂环族氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点-杂环氨基酸,亚氨基酸,杂环族氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点-杂环氨基酸,（2）根据R基团的极性,非极性R基氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸等8种 极性但不带电荷的R基氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等7种带负电荷的R基氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸带正电荷的R基氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸3种,非极性R基氨基酸,（2）根据R基团的极性,极性但不带电荷的R基氨基酸,（2）根据R基团的极性,带负电荷的R基氨基酸,（2）根据R基团的极性,带正电荷的R基氨基酸,（2）根据R基团的极性,（3）根据酸碱性质,酸性氨基酸 一氨基二羧基氨基酸，有天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸 二氨基一羧基氨基酸，有赖氨酸、精氨酸、组氨酸中性氨基酸 一氨基一羧基氨基酸，除上述酸性和碱性氨基酸外，其余15种氨基酸都属于中性氨基酸,（4）按氨基酸是否能在人体内合成,必需氨基酸 指人体内不能合成的氨基酸，必须从食物中摄取，有8种：赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸半必需氨基酸 指人体内可以合成但合成量不能满足人体需要（如发生代谢障碍、婴幼儿生长时期）的氨基酸，有2种：组氨酸、精氨酸非必需氨基酸 指人体内可以合成的氨基酸。包括除了上述必需和半必需氨基酸外，其余的10种氨基酸,-丙氨酸,-氨基丁酸,H2N-CH2-CH2-COOH,H2N-CH2-CH2-CH2-COOH,2.2 不常见的蛋白质氨基酸与非蛋白质氨基酸,甲状腺氨酸,氨基脂肪酸,焦谷氨酸,肌氨酸,甜菜碱,重氮丝氨酸,高(同型)丝氨酸,羊毛硫氨酸,氯霉素,环丝氨酸,肾上腺素,含于血液中的复合胺,青霉胺,3.1 氨基酸的一般物理性质,形状和味感-氨基酸都是白色晶体，各种氨基酸结晶形状不同，滋味不同溶解性和熔点 除胱氨酸和酪氨酸外，氨基酸一般都能溶于水中，但各种氨基酸在水中的溶解度差别很大。除脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中以外，所有氨基酸易溶于稀酸或稀碱溶液中。氨基酸的熔点很高，一般在200以上旋光性 除甘氨酸外，所有天然氨基酸含有至少一个手性-碳原子，因此都具有旋光性,光吸收性 在可见光区域，20多种氨基酸都没有光吸收，但在红外区和远紫外区域（220 nm）均有光吸收。由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分子中R基含有苯环共轭键系统，故在近紫外区显示特征性的吸收谱带，酪氨酸的max275nm，苯丙氨酸的max257nm，色氨酸的max280nm，以色氨酸吸收最强。可利用此性质采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。,3.1 氨基酸的一般物理性质,3.2 氨基酸的酸碱性质,氨基酸的两性解离 氨基酸的等电点 氨基酸的甲醛滴定,3.2.1 氨基酸的两性解离,氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在晶体状态或在水溶液中主要是以兼性离子的形式存在：,兼性离子亦称偶极离子，是指在同一氨基酸分子上带有能放出质子的-NH3+正离子和能接受质子的-COO负离子，是两性离子,加酸时,H+,H+,总电荷“+”,3.2.1 氨基酸的两性解离,加碱时,总电荷“”,OH,OH,3.2.1 氨基酸的两性解离,完全质子化的氨基酸可以看成是多元酸，侧链不能解离的中性氨基酸可看作是二元酸,它的分步解离如下：,3.2.1 氨基酸的两性解离,其中K1和K2分别代表第一步解离（-碳原子上-COOH的解离）和第二步解离（-碳原子上-NH3+的解离）的（表观）解离常数。其数值为K1=Ao H+/A+K2=A-H+/Ao,3.2.1 氨基酸的两性解离,通过测定滴定曲线可以求得氨基酸的解离常数,C,O,O,C,H+H+,H,3,N,+,H,C,O,O,H,C,H,H,3,N,+,H,C,O,O,C,H+H+,H,2,N,H,K2,Gly+,Gly,Gly,K1=AOH+/A+K2=AH+/AO,3.2.1 氨基酸的两性解离,pH=pK+log,质子受体,质子供体,通过氨基酸的滴定曲线，当已知pK1和 pK2等数据时，可用下列Handerson-Hasselbalch公式求出在任一pH条件下一种氨基酸溶液中各种离子所占的比例,3.2.1 氨基酸的两性解离,当溶液为某一pH值，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等时(净电荷为0),这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态,3.2.2 氨基酸的等电点,C,O,O,C,H,H,3,N,+,R,C,O,O,C,H,H,2,N,R,在酸性溶液中（pH pI）,在晶体状态或水溶液中（pH=pI）,在碱性溶液中（pHpI）,3.2.2 氨基酸的等电点,丙氨酸pI的计算,C,O,O,C,H+H+,H,3,N,+,CH3,C,O,O,C,H,H,2,N,CH3,Ala+,Ala,Ala,K1=AlaH+/Ala+Ala+=AlaH+/K1K2=AlaH+/Ala Ala=Ala K2/H+到达等电点时，Ala+=AlaAla H+/K1=Ala K2/H+，即：K1 K2=H+2两边取负对数：lg H+2=lg K1lg K2 lg H+=pH lg K1=pK1 lg K1=pK2 2pH=pK1 pK2 令pI为等电点时的pH，则：pI（pK1 pK2）/2,+H+,3.2.2 氨基酸的等电点,天冬氨酸pI的计算,Asp+,Asp,Asp,C,O,O,C,H,H,3,N,+,CH2,C,O,O,H,C,O,O,C,H,CH2,Asp=,C,O,O,C,H,H,2,N,CH2,C,O,O,等电点时为Asp pI（pK1 pKR）/2,H,3,N,+,3.2.2 氨基酸的等电点,赖氨酸pI的计算,Lys+,Lys+,Lys,C,O,O,H,C,H,H,3,N,+,(CH2)4,NH3+,C,O,O,C,H,H,3,N,+,(CH2)4,NH3+,C,O,O,C,H,H,2,N,(CH2)4,NH3+,K1,K2,KR,Lys,C,O,O,C,H,H,2,N,CH2,NH2,等电点时为Lys pI（pK2 pKR）/2,3.2.2 氨基酸的等电点,pI=(pK1+pKR)/2,pI=(pKR+pK2)/2,侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR)/2 碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR)/2,3.2.2 氨基酸的等电点,氨基酸不能直接用酸、碱滴定定量测定其原因是氨基酸的酸、碱滴定终点时pH过高（1213）或过低（12），超出酸碱滴定指示剂的显色范围若向氨基酸溶液中加入过量的甲醛，由于甲醛与氨基酸中的氨基（-NH2）反应生成羟甲基化合物而降低氨基的碱性，反应向右进行，促进了氨基酸-NH3+的酸性解离，释放出H，使反应的终点pH从1213下降至9附近，可以用酚酞作指示剂用标准NaOH溶液加以滴定这就是氨基酸的甲醛滴定法,3.2.3 氨基酸的甲醛滴定,甲醛反应,R,CH,NH3+,COO,HCHO,R,CH,NHCH2OH,HCHO,R,CH,N(CH2OH)2,羟甲基氨基酸,二羟甲基氨基酸,COO,COO,3.2.3 氨基酸的甲醛滴定,-氨基参加的反应-羧基参加的反应-氨基和-羧基共同参加的反应 侧链R基参加的反应,4 氨基酸的常见化学反应,巯基反应颜色反应,茚三酮的反应成肽反应,与亚硝酸酰基化烃基化形成西佛碱脱氨基和转氨基,成盐和成酯成酰氯叠氮脱羧,4 氨基酸的常见化学反应,4.1-氨基参加的反应,与亚硝酸反应 酰基化反应 烃基化反应 形成西佛碱反应 脱氨基和转氨基反应,4.1.1 与亚硝酸反应,原理：自由氨基能与亚硝酸反应释放出氮气，每克分子的自由氨基可生成一克分子氮气在生产上常用此法来测定蛋白质的水解程度,R,CH,COOH,NH2,+HNO2,R,CH,COOH,OH,+N2,+H2O,4.1.2 酰基化反应,氨基酸的氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应生成酰胺该反应在多肽和蛋白质的人工合成中可用于保护氨基常用的酰化试剂包括苄氧甲酰氯、对甲苯磺酰氯、叔丁氧甲酰氯、邻苯二甲酸酐、丹磺酰氯等,5-二甲氨基萘磺酰氯（丹磺酰氯）。它具有强烈的荧光，可用荧光光度计快速检出，灵敏度高,4.1.2 酰基化反应,丹磺酰氯反应,4.1.2 酰基化反应,4.1.3 烃基化反应,氨基酸氨基的一个氢原子可被烃基（包括环烃及其衍生物）取代例如在弱碱性溶液中，氨基酸的-氨基很容易与2,4-二硝基氟苯作用，生成稳定的黄色2，4-二硝基苯基氨基酸,AADNFB+多肽 蛋白,+HF,DNP-AA DNP-多肽 DNP-蛋白,原理：在弱碱性溶液中，氨基酸的-氨基很容易与DNFB作用，生成稳定的黄色DNP-氨基酸（2，4一二硝基苯氨基酸）,多肽或蛋白质N-末端氨基酸的-氨基也能与DNFB反应用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸,亦称Sanger反应,4.1.3 烃基化反应,R,CH,NH2,+HF,+,NO2,F,COOH,R,CH,N,COOH,H,pH89,NO2,DNP-氨基酸,4.1.3 烃基化反应,用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸,亦称Edman反应,弱碱,AAPITC+多肽 蛋白,AAPTC多肽 蛋白,HF,PTH-AA+少一个AA的多肽或蛋白,苯异硫氰酸酯,苯氨基硫甲酰-,苯乙内酰硫脲,4.1.3 烃基化反应,苯异硫氰酸酯,苯氨基硫甲酰-,苯乙内酰硫脲,4.1.3 烃基化反应,4.1.4 形成西佛碱反应,氨基酸的-氨基与醛类化合物反应，生成称为西佛碱的弱碱赖氨酸的侧链氨基也能发生该反应,4.1.5 脱氨基和转氨基反应,氨基酸在氧化剂或酶（如氨基酸氧化酶）的催化作用下可脱去-氨基，转变成相应的-酮酸是生物体内氨基酸分解代谢的重要方式之一,4.2-羧基参加的反应,成盐和成酯反应 成酰氯反应 叠氮反应 脱羧反应,4.2.1 成盐和成酯反应,氨基酸与碱作用即生成盐，其中重金属盐不溶于水氨基酸的羧基可与醇反应，生成相应的酯,4.2.2 成酰氯反应,将氨基酸的氨基用适当的保护基（如苄氧甲酰基）保护以后，其羧基可与五氯化磷或二氯亚砜作用生成酰氯该反应使氨基酸的羧基活化，使之易与另一氨基酸的氨基结合，因此常用于多肽的人工合成,4.2.3 叠氮反应,YNH,CH,COOH,R,NH2NH2,+2H2O,YNH,CH,CO NH NH,R,HNO2,YNH,CH,CON3,R,用途：可活化羧基，常用于人工合成肽过程,酰化氨基酸,酰化氨基酸的肼衍生物,酰化氨基酸叠氮,4.2.4 脱羧反应,在氨基酸脱羧酶的催化下，生物体内的氨基酸可脱去羧基，放出二氧化碳并生成相应的一级胺。,肉类腐败,4.3-氨基和-羧基共同参加的反应,与水合茚三酮反应 成肽反应,用途：常用于氨基酸的定性或定量分析,4.3.1 与水合茚三酮反应,脯氨酸及羟脯氨酸与茚三酮反应产物 黄色化合物,N+,4.3.1 与水合茚三酮反应,一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物叫肽，形成的键叫肽键，又称为酰胺键，写作-CO-NH-在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。,4.3.2 成肽反应,4.4 侧链R基参加的反应,半胱氨酸侧链上巯基参与的反应 侧链R基参加的重要颜色反应,4.4.1 半胱氨酸侧链上巯基参与的反应,与卤化烷（如碘乙酸、碘乙酰胺、甲基碘等）迅速反应，生成相应的稳定烷基衍生物可用于巯基的保护，应用在肽合成工作中,半胱氨酸的巯基能打开乙撑亚胺（又称氮丙啶）的环，生成S-氨乙基半胱氨酸（AECys）。可用于巯基的保护。,4.4.1 半胱氨酸侧链上巯基参与的反应,巯基很容易受空气或其它氧化剂氧化，一种是半胱氨酸氧化形成二硫键。（disulfide bond），生成胱氨酸，-SH与-S-S-自成一氧化还原体系，在机体氧化还原作用中起一定作用。,4.4.1 半胱氨酸侧链上巯基参与的反应,二硫键：是由二个半胱氨酸残基的侧链之间形成的。即胱氨酸的残基中的二硫键。二硫键类型：可以使两条单独的肽链共价交联起来（链间二硫键）；也可以使一条链的某一部分形成环（链内二硫键）。,4.4.2 侧链R基参加的重要颜色反应,米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液；当蛋白溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色；由于酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故有此反应。Tyr中的酚基能将Folin试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物），利用该反应，可以检测Tyr或含Tyr的蛋白质。芳香族氨基酸，特别是Tyr、Trp或含Tyr、Trp的蛋白质在溶液中遇到硝酸后，先产生白色沉淀，加热则变黄，再加碱颜色加深为橙黄色。这是因为苯环被硝化，产生了硝基苯衍生物。皮肤、毛发、指甲遇浓硝酸都会变黄。,坂口反应:Arg的胍基能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质，可用来鉴定含有Arg的蛋白质，也可用来定量测定Arg的含量。乙醛酸反应 凡含有吲哚基的化合物都有乙醛酸反应，由于Trp含有类似结构，因此Trp或含Trp的蛋白质都有此反应。在Trp或含Trp的蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环。,4.4.2 侧链R基参加的重要颜色反应,5 氨基酸的光学特性,Lined up by similarity:chiral to chiral,COO to CHO,Rules for description of chiral centers in the(R,S)system,6 氨基酸的分离纯化结构鉴定,