感染性疾病的分子诊断.ppt
感染性疾病的分子诊断,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,二、耐药监测与分子流行病学调查,三、医院获得性感染的监测与控制,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测等检测核酸分子或蛋白质分子目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,（一）结核分枝杆菌,（二）乙型肝炎病毒,（三）人类免疫缺陷病毒,（四）SARS冠状病毒,（五）人禽流感病毒,结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。,（一）结核分枝杆菌,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,（一）结核分枝杆菌,1.生物学特性与致病性,2.基因组特点,3.结核分枝杆菌核酸的检测,（一）结核分枝杆菌,1.生物学特性与致病性 结核分枝杆菌复合群包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，其中前三者对人类致病 人型结核分枝杆菌感染的发病率最高,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,结核分枝杆菌生长缓慢，增殖一代需1520小时，生长成可见菌落一般需46周 在组织细胞内大量繁殖引起炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及菌体成分诱发的机体免疫损伤,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,2.基因组特点 共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4kb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,(1)重复序列：如IS6110，仅存于结核分枝杆菌复合群细菌染色体上长1355bp的重复插入序列，具有复合群特异性(2)蛋白质编码基因(3)rRNA基因：每个细胞约含有103104 个rRNA，含有结核分枝杆菌高度保守的序列，也有分枝杆菌种特异性序列,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,3.结核分枝杆菌核酸的检测 实验室检查手段主要包括标本直接涂片染色镜检、分离培养鉴定以及血清学抗原检测方法 分子生物学理论和技术已经用于分枝杆菌的分子结构和功能的研究中，并开始用于临床菌种和耐药株的鉴定及监测,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,PCR菌种鉴定法PCR直接测序鉴定法PCR-DNA探针鉴定法PCR-基因芯片法,(1)结核分枝杆菌菌种鉴定：,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,(2)药物敏感性试验与耐药基因检测：缩短培养和鉴定的时间，及时指导临床选药药物敏感性试验直接检测耐药基因,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,（二）乙型肝炎病毒,1.生物学特性及致病性,2.乙型肝炎病毒核酸的检测,3.变异株与耐药突变检测,乙型肝炎病毒简称乙肝病毒。是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗粒状，也会被称为丹娜颗粒（Dane）。1965年由丹娜发现。直径为42纳米。颗粒分为外壳和核心两部分。,（二）乙型肝炎病毒,1.生物学特性及致病性 HBV对外界环境的抵抗力较强，且传染性较强输血或注射是重要的传播途径HBV感染后潜伏期约26个月，HBV DNA在肝细胞内以游离DNA和整合到宿主细胞染色体的方式存在 HBV分为8个基因型，AH型,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,2.乙型肝炎病毒核酸的检测,（1）荧光定量PCR技术：测定HBV病毒载量 HBV DNA 107拷贝/毫升，提示病毒复制活跃 HBV DNA 103拷贝/毫升、HBeAg转为阴性，正常的病人预后相对较好,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,（2）支链DNA（bDNA）技术：一种核酸探针杂交标志信号放大技术。优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单，将待测病毒裂解释放核酸后变性为单链，即 可进行检测。缺点：敏感性较低、检测范围窄而不适用于低水平病 毒的检测。,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,还可以用于乙肝病毒基因检查的方法主要有：荧光PCR法、竞争PCR法、PCR酶联免疫吸附法、荧光标记物法和PCR酶联化学发光等方法。,3.变异株与耐药突变检测,HBV可能发生自然变异HBV在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变异 HBV基因组的变异常引起病毒生物学特性的改变，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带来困难,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,HBV耐药突变类型及其核苷酸、氨基酸变化,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,（三）人类免疫缺陷病毒,1.形态结构与致病性,2.HIV核酸检测,人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）。,（三）人类免疫缺陷病毒,1.形态结构与致病性 HIV根据血清学反应和病毒核酸序列分为 HIV-1型、HIV-2型 HIV结构分为 包膜、核心,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,HIV直接或间接损伤CD4+T细胞 HIV抑制抗原递呈细胞功能 HIV诱发自身免疫性疾病及诱导细胞凋亡 HIV导致CD8+T细胞丧失抗病毒活性等,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,HIV感染以侵犯CD4+T细胞为主,原位杂交 PCR NASBA技术 bDNA技术 荧光定量RT-PCR技术,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,2.HIV核酸的检测的分子生物学方法,（四）SARS冠状病毒,从SARS病人体内分离到的冠状病毒与任何以往确定特征的冠状病毒关系不密切，且该病毒的有限区域的复制酶（rep）基因序列与其它冠状病毒明显不同，因而被称为SARS相关冠状病毒。,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,SARS相关冠状病毒的检测 WHO推荐SARS-CoV特异性检测方法：分子生物学检测 免疫学检测 细胞分离培养,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,免疫学方法难以在感染的窗口期对病毒感染进行早期检测 细胞培养所需时间较长，分离阳性率不高 PCR方法可以确诊早期疑似病人，但PCR试验阴性并不能说明没有SARS-CoV感染,（五）人禽流感病毒,人禽流行性感冒（简称人禽流感）是由禽甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的急性呼吸道传染病，感染者大多因多脏器功能衰竭而死亡。,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,近年来，由H5N1亚型禽流感病毒引起的疫情广泛传播对人类的健康造成全球性的重大威胁。由于病毒的不断变异，开发新型抗流感药物成为各国极为迫切的重大课题。其中，揭示与流感病毒密切相关的蛋白质的三维结构不仅对揭示流感病毒复制机制具有重要科学意义，而且对开发抗流感病毒药物具有重要价值。最近，由中科院生物物理研究所刘迎芳研究员领导的研究组和饶子和院士领导的研究小组在这一领域取得突破性进展，他们在国际上率先揭示了流感病毒聚合酶关键部分PA亚基与PB1多肽复合体的精细三维结构。,（五）人禽流感病毒,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,1.病原学特征及致病性,2.人禽流感病毒的检测,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,1.病原学特征及致病性 禽流感病毒属甲型流感病毒，基因组为单股负链RNA依外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分为15个H亚型和9个N亚型感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情最重,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,2.人禽流感病毒的检测(1)病毒核酸检测：RT-PCR技术从病人呼吸道标本中检测禽流感病毒亚型特异性H抗原基因。(2)病毒抗原蛋白质分子检测：取病人呼吸道标本采用免疫荧光法检测甲型流感病毒核蛋白抗原及禽流感病毒H亚型抗原。,二、耐药监测与分子流行病学调查,（一）耐药突变检测,（二）分子流行病学调查,二、耐药监测与分子流行病学调查,PCR-RFLPSSCPDGGEPCR-反向斑点杂交技术DNA序列分析芯片技术等,（一）耐药突变检测,二、耐药监测与分子流行病学调查,追踪和控制传染源及可能的传播途径确定同一病人反复感染是源于复发或再感染明确某一菌株是否与某些临床表现相关，从而发现其特殊的传播和致病机制,（二）分子流行病学调查,二、耐药监测与分子流行病学调查,1.IS6110 RFLP,2.间隔区寡核苷酸探针分型技术,二、耐药监测与分子流行病学调查,1.IS6110 RFLP（限制性片断长度的多态性）IS6110重复序列探针被称为结核分枝杆菌复合群分型的金标准。检测步骤：细菌培养 提取基因组DNA Pvu限制性酶水解 Southern印迹 IS6110探针杂交,IS6110-RFLP分型方法要比基于PCR的分型方法需较多的菌株材料，以产生足够的DNA用于分析。这要求基因分型实验室将菌株接种到培养基中，然后等待足够的培养物长出。与PCR方法（MIRU和spoligotyping分析）不同的是，RFLP分析不能在非活性培养物上进行。,二、耐药监测与分子流行病学调查,2.间隔区寡核苷酸探针分型技术直接重复序列只在结核分枝杆菌复合群细菌染色体的某一位置出现，由多个高度保守的36bp的序列组成，其间被高度保守的3441bp非重复的短序列间隔开 36bp重复序列出现的次数和某些间隔序列的出现或消失，在不同菌株表现出可变性,三、医院获得性感染的监测与控制,医院感染，又称院内感染，是指病人入院时尚未感染，也不处于感染的潜伏期，而是在入院以后（通常指入院48小时后）引起的感染，以及在医院内获得但在出院后才发生的感染,一、与院内感染有关的因素,（一）机体因素 一般病人均处于抵抗力低下状况，几乎所有传染因子均可引起院内感染。一个病人的正常或条件致病菌感染可以转给其他病人。尤其是新生儿免疫机制尚未成熟，老年人随年龄增长发生生理改变，故危险性大。,（二）应用某些诊断或治疗手段 这些人往往对院内感染易感性增加。例如外科手术后保留导管（尤其是静脉内和膀胱内）、气管插管或切开、输血、麻醉、使用免疫抑制药物、抗生素等。,（三）医院中病人集聚 各类病人密集程度和相互接触机会决定了院内感染发生的可能性。医院内耐药菌株常多。一般卫生状况不良为院内感染创造条件。,二、院内感染的种类（一）交叉感染（cross infection）交叉感染是在医院内获得而引起的微生物感染。可以从病人传给病人；病人传给医务人员或从医务人员传给病人或其他病人；病人家属作为带菌者传给病人。（二）环境感染（environmental infection）指接触到被污染过的物品所获得的微生物感染，例如尿布、被单、床架、床头柜、擦桌布、病历卡、门把手、拖把、食具、玩具等。（三）内源性感染（endogenous infection）指来自病人自身的感染，病人本身是病原体携带者，由于全身抵抗力低下而引起自身感染。,三、污染途径（一）空气（二）手（三）医疗器械（四）药品,
