微生物遗传变异与菌种保藏增加内容.ppt

第八章 微生物遗传变异与菌种保藏(增加内容),本章内容：第一节 遗传的物质基础第二节 基因突变及修复第三节 基因重组第四节 微生物诱变育种第四节 菌种的衰退、复壮及保藏,第一节 基因突变与诱变育种,一、基因突变二、突变与育种三、营养缺陷型的筛选,一 基因突变,（一）突变类型（二）突变的特点（三）基因突变自发性及不对应性证明（四）基因突变的机制（五）DNA的损伤及修复,（一）突变类型,细胞形态 1、形态突变型 菌落形态 营养缺陷型 2、生化突变型 抗性突变型 抗原性突变（包括细胞内部、表面成分的改变）,3、致死性突变型（合成关键性酶的基因发生了突变，则表现出致死突变）条件致死突变型 如突变为温度敏感型突变（37死，25活）4、其它突变型 毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等。,（二）突变的特点,1 非对应性：环境与变异无对应性。2 自发性：非人为的诱变因素下发生。3 规律性：某一特定性的突变率具规律性。4 独立性：一个基因的突变对其它基因突变无影响。5 稀有性：生物自发突变率为10-610-12。6 诱变性：诱变剂可提高突变率10105X。7 稳定性：突变性状稳定、可遗传。8 可逆性：有回复突变。,（三）基因突变自发性及不对应性的证明（自学）,自发突变：没有人工诱变因素的参与，生物体自然突变。1、彷徨试验：2、涂布试验：3、平板影印(Replica plating)培养试验：,彷徨试验,（1）抗性细胞的出现，是在接触噬菌体之前（2）喷上噬菌体，仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用；（3）于甲方高度彷徨，说明突变是随机的。,平板影印培养试验,（1）突变与噬菌体无关；（2）涂布使抗性菌株均匀分布；（3）抗性突变可在任何时间发生，与噬菌体存在无关。以上实验用统计学原理间接证明。,影印培养试验,（1）实验表明：从未接触 str 的菌株可发生抗性突变，分离可得到纯的 str 菌株。（2）由此表明：突变是自发的与环境不对应的。,（四）基因突变的机制（自学）,1 DNA的复制（核苷酸对掺入错误）微生物自身产生诱变物质（咖啡碱、硫氢化合物、重氮丝氨酸等）环境对微生物的诱变作用（辐射、加热等）,（五）DNA损伤及修复（自学）,1 光复活作用2 切除修复3 重组修复4 SOS修复,二 突变与育种,（一）自发突变与生产育种（二）诱变育种,（一）自发突变与生产育种,1.生产选育：群体培养中个别的变异个体表现出生长优势，发现突变种后，随时分离、纯化。2.定向培育：用特定的环境长期处理某一微生物群体,同时不断对其移种、传代，以达到积累和选择合适的自发突变 体的一种育种方法。,（1）自发突变(spontaneous)：在非人为的情况下由于遗传物质的微小变化引起的性状变异。（2）原因可能是：1）环境因素；2）自身有毒产物的积累；3）互变异构效应；,3、自发突变的机制,二 诱变育种,1、概念2、诱变剂3.诱变程序4、诱变的主要环节,1、概念 诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,（1）概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。（2）种类：1）物理因子（phisical agents)物理诱变剂：U.V、快中子、超声波等。2）化学因子(chemical agents)3）转座子(transposable elements),2、诱变剂,烷化剂(alkylating agents)：如：氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等 机制：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质。,化学诱变剂：,碱基类似物(base analogs)：如：叠氮胸腺嘧啶（AIT）等；机制：在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中，而碱基 类似物没有正常碱基的氢键性质，在DNA复制时 出现突变体。,插入剂(intercalating agents):如：溴化乙啶等一些三环分子。机制：与DNA中的一对碱基有大致相同的位点，这些分子不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋中，加宽间距，引起碱基增加。t,3.诱变程序：,原始菌种 原菌种特性鉴定 纯化 斜面/肉汤 培养单孢子/单细胞悬液 诱变剂处理 计算存活率 平板分离 观察形态变异，挑单菌落 移至斜面 初筛 复筛 小试 良种保藏 中试,4 诱变的主要环节,（1）诱变剂的选择（2）出发菌株的选择（3）单孢子或单细胞悬液的制备（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法,（1）诱变剂的选择：1）了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。2）处理方式 A、单一因子处理：先后使用 B、复合因子处理：两种以上因素同时使用单一 因子重复使用。3）处理剂量：测致死率。方法：平板菌落计数法、纸片法 一般杀菌率为70%左右。,（2）出发菌株：育种的原始菌种应具备：1）对诱变剂的敏感性高；2）生产中选育过的自发变异菌株；3）本身具有一些有利性状；4）对代谢产物有一定积累；5）已经发生过某些变异。,（3）单孢子或单细胞悬液的制备 1）必要性：单细胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不纯的菌落菌种退化。2）制备：物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl)化学诱变剂缓冲液。3）方法：三角瓶内加0.5cm玻璃珠打散10-15min;加.3%吐温80（表面活性剂），用无菌脱脂棉过滤。4）浓度：细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法 1）初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的生理效应范围。方法 梯度平板法（抗性菌株）纸片法（抗性菌株）透明圈法（淀粉酶产生菌株等）变色圈法（氨基酸生产菌株）2）复筛：（见P250）较精确的生物化学分析方法做摇瓶测定,三、营养缺陷型的筛选,（一）概念（二）筛选方法,（一）概念,1.三种遗传型个体2、筛选用的培养基,1.三种遗传型个体,（1）营养缺陷型（auxotroph）：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys-;bio-;（2）野生型(wild type)：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：lys+;bio+;（3）原养型(prototroph)：指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,2、筛选用的培养基,1）基本培养基（minimal medium,MM）-：满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。2）完全培养基（complete medium,CM）+：满足一切auxo生长的天然或半组合培养基。3）补充培养基（supplemented medium,SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应 auxo生长的组合培养基。,（二）筛选方法,1、诱变处理2、auxo的浓缩3、auxo的检出4、auxo的鉴定5、auxo的应用,1.诱变处理（同前),auxo的筛选程序：细菌培养 离心洗涤 诱变处理 CM后培养 洗涤 MM加PN 涂布于CM平板 影印培养 挑取 鉴定 菌种保存。,2.auxo的浓缩：,（1）抗生素法：1）原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。2）方法：菌培养在含抗生素的MM基中。（2）菌丝过滤法：1）适用于丝状（放线菌、霉菌）2）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。（3）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留auxo芽孢。细菌80 酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。,3.auxo的检出,（1）逐个检出法（2）影印平板培养法（3）限量补充法（在mm中加0.01%蛋白胨，auxo菌落小，野生型大）（4）夹层培养法,4.auxo的鉴定,（1）生长谱法 1）方法简便；2）回变和污染不影响结果 3）测定物质可为粉末或纸片（2）混合氨基酸（Vit）法混合氨基酸法步骤：1）将多种营养因子编组，如：2）将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养 3）结果分析4）营养因子分组编排时注意：A、每组内无重复的营养因子 B、每组中应包含只出现一次的因子 C、每组中其他因子应分别出现二次,一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,5.auxo 的应用,（1）作为标记菌株：进行基因工程、诱变育种、代谢过程的研究中的亲本标记；（2）作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；（3）作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,第二节 基因重组,一、原核生物的基因重组 二、真核生物的基因重组,基因重组把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传物质重新组合后，形成新遗传型个体的方式。基因重组分子水平的杂交 一般杂交细胞水平,如：甲 乙生长快、产量低 生长慢、产量高 基因重组 生长快、产量高,一、原核生物的基因重组,（一）转化（transformation)（二）转导(transduction)（三）接合(conjugation)（四）原生质体融合（protoplast fusion）,（一）转化（transformation),概念 受体细胞(receptor)直接吸收了来自供体细胞(donor)的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。,1.感受态2.感受态因子3.转化因子4.转化的检出,（1）感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。（2）转化的决定因素：不同菌株的亲缘关系;受 体细胞是否处于感受态；不同菌出现感受态的时间不同。,1.感受态,一种胞外蛋白质，分子量为510kD其作用为：（1）催化转化，促进外来DNA片段吸收。（2）可降解细胞表面某种成分，使DNA受体暴露。1）不同菌细胞DNA受体位点不同。2）有的菌感受态因子只对同种菌起作用。,2.感受态因子,3.转化因子,（1）转化因子由供体提供（2）一般为线状或闭合环状；单链或双链；双链 有转化能力，单链没有。（3）自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生；实验室里 通过提取获得。（4）转化的频率往往很低，一般为0.11%。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高。,游离的片断叫转化因子,4.转化的检出,甲-受体strr，lys-在含str的MM上培养乙-供体strs，lys+如出现strr，lys+的菌株，则表明已经转化。,