微生物的生长繁殖及其控制.ppt

第六章微生物生长繁殖及其控制,Microbial growth and its control,一个微生物细胞,群体的生长,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢,同化作用异化作用,个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）不断增加,各细胞组分是按照恰当的比例增长，达到一定程度后就会繁殖，引起个体数目的增加,群体内各个体的进一步生长,生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长=个体生长+个体繁殖,第一节 细菌的生长,第二节 细菌的群体生长繁殖,单细胞微生物群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（eneration time,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时也称为倍增时间。,一、细菌的群体生长规律,细菌生长曲线：把一定的细菌细胞接种在恒定容积的液体培养基中在适宜条件下培养，定时取样测定细胞数目，以细菌细胞数的对数为纵坐标，以生长时间作横坐标绘制而成的曲线。,生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,典型的生长曲线（Growth curve）,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：生长速率常数=0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物：,（1）延滞期（lag phase，停滞期、调整期、适应期）,菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素：,认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短lag phase 的措施有：通过遗传学方法改变种的遗传特性使延迟期缩短；采用对数生长期的健壮菌种；尽量使接种前后所使用的培养基组成成分相差不要太大；适当扩大接种量（群体优势-适应性增强）。,（2）对数期（logarithmic phase，指数期）,现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。特点：生长速率常数最大，即代时最短；细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致；代谢最旺盛；细胞对理化因素较敏感3.影响因素：菌种、营养成分及浓度、温度,营养物浓度与对数期生长速率和产量,作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子,细胞数或菌体量,应用意义：由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,（3）稳定期（stationary phase，恒定期或最高生长期）,1、特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。2、产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）；物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;,应用意义：1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pH 调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。,（4）衰亡期（decline phase）,特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronous growth），进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步培养：是使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,二、同步培养,获得同步生长的方法：,获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,Helmstetter-Cummings 法,原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,三、连续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuous culture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,连续培养原理,连续培养器,按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分,内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器,单级连续培养器多级连续培养器,一般连续培养器固定化细胞连续培养器,实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐,连续培养器,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,连续培养技术恒浊培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,连续培养技术恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究,恒化器Chemostat 或bactogen,恒浊器与恒化器的比较,生长与代谢产物的形成存在两种类型,微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：,连续发酵（continuous fermentation）,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。,第三节 真菌的生长与繁殖,一、丝状真菌的生长繁殖（一）无性孢子,霉菌的繁殖方式,)：,1.孢囊孢子（sporangiospore）,形成特征：形成于菌丝的特化结构孢子囊内。孢子形态：近圆形。举例：根霉、毛霉。,2.分生孢子(Canidinm):,形成特征：由分生孢子梗顶端细胞特化而成的单个或簇生的孢子。孢子形态：极多样。举例：曲霉、青霉。,2.分生孢子(Canidinm):,无性孢子结构复杂的子实体,3、节孢子(arthrospore，又称粉孢子),形成特征：由菌丝断裂而成。孢子形态：常呈成串短柱状。举例：白地霉。,4.厚垣孢子（Chlamydospore),形成特征：部分菌丝细胞质浓缩、变圆，周围生出厚壁而成。孢子形态：圆形、柱形等。举例：总状毛霉。,（二）有性繁殖,（1）过程 两相邻的不同质的（细胞）菌丝碰到一起形成原配子囊。质配 接触处的细胞壁溶解，两细胞质融合在一起核配 形成二倍体结合子核减数分裂（R）恢复核的单倍体状态有些霉菌核配后，双倍体核进行减数分裂形成单倍体有性孢子，有的霉菌核配合后，二倍体的结合子直接发育形成有性孢子（二倍体的），萌发时才进行减数分裂。（2）方式,有性结构及其形态特征：由大小不同的配子囊结合后发育而成。小配子囊称雄器；大配子囊称藏卵器。所属分类地位：卵菌纲。,1.卵孢子（oospore),2.接合孢子（zygospore):,有性结构及其形态特征：是由菌丝生出的结构大小相似、形态相同或略有不同两个配子囊接合后发育而成。所属分类地位：接合菌纲,接合孢子形成过程:,根据产生接合孢子的菌丝来源或亲和力不同,可将结合分为分为两种情况：同宗配合(Hemothallism)：是单一的孢子囊孢子萌发后形成的菌丝，甚至同一菌丝的分枝相互接触，而形成接合孢子的过程。异宗配合(Heterothallism)：是不同菌系的菌丝相遇后，才能形成接合孢子，这两种有亲和力的菌系在形态上并无区别。,同宗配合与异宗配合：,3.子囊孢子（ascospore):,有性结构及其形态特征：在子囊中形成。子囊：两性细胞接触以后形成的囊状结构。子囊的形成有两种方式：两个营养细胞直接交配而成，其外面无菌丝包裹；从一个特殊的、来自产囊体菌丝（称为产囊丝）的结构上产生子囊，多个子囊外面被菌丝包围形成子实体，称为子囊果。所属分类地位：子囊菌纲,子囊果的形状,子囊果(Ascocarp)：子实体（一种有性结构),多个子囊外部由菌丝体组成共同的保护组织结构,称为子囊果。子囊包在其中。子囊果有三种类型：,闭囊壳(Cleistothecium),子囊壳(Perthecium),子囊盘(Apothecium),4.担孢子(basidiospore),有性结构及其形态特征：担子菌所特有，经两性细胞核配合后产生的外生孢子。因着生在担子上而得名。所属分类地位：担子菌纲,丝状微生物的群体生长,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。,可分为三个阶段：生长停滞期、迅速生长期、衰退期,1、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。,丝状微生物的群体生长,二、酵母菌的生长繁殖,根据能否进行有性繁殖，可将酵母菌分为：假酵母：只有无性繁殖过程。真酵母：既有无性繁殖，又有有性繁殖过程。,1、芽殖,出芽方式：多边出芽、两端出芽、三边出芽、单边出芽。环境适宜时，可出现假菌丝,芽殖过程：母细胞形成小突起（AD）核裂（EG）原生质分配（HI）新膜形成（JK）形成新细胞壁（L）,出芽痕和诞生痕：酵母出芽繁殖时，子细胞与母细胞分离，在子、母细胞壁上都会留下痕迹。在母细胞的细胞壁上出芽并与子细胞分开的位点称出芽痕，子细胞细胞壁上的位点称诞生痕。由于多重出芽，致使酵母细胞表面有多个小突起。,芽 痕,Bread Yeast with Bud,假菌丝:,Saccharomyces cerevisiae的芽殖过程,有的酵母菌进行芽殖后，长大的子细胞不与母细胞立即分离，并继续出芽，细胞成串排列，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。而霉菌的菌丝为真菌丝，即相连细胞间的横隔面积与细胞直径一致，呈竹节状的细胞串，称为真菌丝。,借细胞横分裂法繁殖,与细菌类似.如Schizosaccharomyces octosporus（八孢裂殖酵母）。进行裂殖的酵母菌种类较少.,2、裂 殖；,有性繁殖的过程：当酵母菌发展到一定阶段，两性别不同的细胞接近各伸出突起而相接触，接触出的细胞壁溶解，两细胞的细胞质通过形成的管道融合，两单倍体的核移到融合管中形成二倍体核，在合适的条件下，二倍体细胞核进行减数分裂性成子囊，子囊内的单倍体细胞便为子囊孢子，在适宜条件下可萌发成单倍体细胞。即两性别不同的单倍体细胞相互结合质配核配二倍体营养细胞子囊形成成熟后囊壁破裂放出子囊孢子萌发成单倍体细胞。,有性生殖,有性生殖,即两性别不同的单倍体细胞相互结合质配核配二倍体营养细胞子囊形成成熟后囊壁破裂放出子囊孢子萌发成单倍体细胞。,一、环境对微生物生长的影响 适宜环境 促进微生物生长发育 不适宜环境 微生物受抑制或突变 恶劣环境 微生物死亡,第三节 环境对生长的影响及生长的测定,影响微生物生长的外界因素很多，有许多物理化学条件。,温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在：影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。,（一）温度对微生物生长的影响,微生物的生长温度生长温度三基点,即微生物的最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。,微生物生长温度类型,根据微生物的最适生长温度的不同，将微生物划为低温型微生物（嗜冷微生物）中温型微生物（嗜温微生物）高温型微生物（嗜热微生物）,低温型微生物（嗜冷微生物）:最适生长温度在520，主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中。例：假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷藏食品的腐败。嗜冷微生物在低温下生长的机理，目前还不清楚，据推测有两种原因：它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活丧失细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，可以进行物质的传递。,中温型微生物（嗜温微生物）：最适生长温度为2040，大多数微生物属于此类。室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。体温型主要为寄生，在人和动物体内。,高温型微生物（嗜热微生物）：最适生长温度为50 60，主要分布在温泉、堆肥和土壤中。在高温下能生长的原因：酶蛋白以及核糖体有较强的抗热性核酸具有较高的热稳定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成 氢键，增加热稳定性）。细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常的液晶状态。高温微生物的特点:生长速度快，合成大分子迅速，可及时修复高温对其造成的分子损伤。耐高温菌具应用优势：在减少能源消耗、减少染菌、缩短发酵周期等方面具重要意义。,1、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。微生物对热的耐受力与以下因素有关:(1)微生物种类及发育阶段 嗜热菌比其它类型的菌体抗热有芽孢的细菌比无芽孢的菌抗热微生物的繁殖结构比营养结构抗热性强老龄菌比幼龄菌抗热,高温与低温对微生物的影响,(2)微生物对热的耐受力还受环境条件的影响 与培养基的营养成分有关 培养基中蛋白质含量高时比较耐热.与pH 有关 pH适宜时不易死亡，pH不适宜时，容易死亡.与水分有关 含水量大时容易死亡，含水量小时不容易死亡.与含菌量有关 含菌量高，抗热性增强，含菌量低，抗热性差。与热处理时间有关 热处理时间长，微生物易死亡。,当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。,2、低温对微生物的影响,造成死亡的原因：冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。冻结过程造成细胞脱水。冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:专性好氧菌:好氧菌 微好氧菌：兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌：厌氧菌(专性)厌氧菌：,（二）氧气对微生物生长的影响,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性厌氧菌（facultative aerobe）,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，H2O2、O2 等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂，降低 培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,影响胞内许多对酸碱不稳定的成分影响膜表面电荷的性质及膜的通透性影响酶活,（三）pH值与微生物生长的相互影响,1、环境pH值对微生物生长的影响,微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为：嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌,2、不同微生物对pH要求不同,同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要。举例：Aspergillus niger在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。丙酮丁醇梭菌在pH5.57.0范围时，以菌体生长为主，而在pH4.35.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH灰色链霉菌6.36.96.77.3红霉素链霉菌6.67.06.87.3产黄青霉6.57.26.26.8金霉素链霉菌6.16.65.96.3灰黄青霉6.47.06.26.5,3、生长的最适pH值与发酵的最适pH值,同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌 在pH值=5.57.0时，以菌体生长为主 在pH值=4.35.3时，进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。例如：黑曲霉pH值=23时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。,4、微生物细胞内的pH值,虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。,5、微生物的生命活动对环境pH值的影响,微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因：由于有机物分解：分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降；分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升由于无机盐选择性吸收：铵盐吸收（(NH4)2SO4 H2SO4），pH硝酸盐吸收(NaNO3 NaOH)，pH,培养过程中调节pH值的措施过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。,NH4+被吸收,NO3+被吸收,配制培养基时调整pH值的措施：,pH控制,“治标”：指根据表面现象而进行直接、及时、快速但不持久的表面化调节。“治本”：指根据内在机制而采用的间接、缓效但可发挥持久作用的调节。,6、酸碱添加剂的抑菌机理,酸类物质：无机酸：与H+浓度成正比的高氢离子浓度，可引起菌体表面蛋白的变性和核酸的水解，并破坏酶类的活性有机酸：与不电离的部分成正比,故有时有机酸的抑菌效果无机酸。作为食品防腐剂的有机酸如苯甲酸和水杨酸可与微生物细胞中的成分发生氧化作用，从而抑制微生物的生长。碱类物质：强碱可引起蛋白质、核酸大分子变性、水解，以杀死或抑制微生物。食品工业中常用石灰水、NaOH、Na2CO3等作为机器、工具以及冷藏库的消毒剂。,酸类在食品、饲料中的应用,酸类的应用：A改进风味 发酵食品（酸奶、泡菜、产乳酸，增进食欲、开胃、抑肠道菌）；青贮饲料（增加饲料的适口性）；酸渍食品（腌酸黄瓜、凉拌菜加醋、大蒜，杀菌、增味）B杀菌、作防腐剂 使微生物处于被抑制状态。,二、微生物生长的测定方法,描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。（一）微生物细胞数目的检测法直接法（血球计数板、比例计数法）间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法）（二）微生物生长量和生理指标测定法直接法(干重法，堆体积法)间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）,1.血球计数板法,原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,2.涂片染色法,应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数涂布面积/视野面积100 稀释倍数,3.平板菌落计数法,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,A standard plate count(viable count)reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony;plate counts are reported as number of colony-forming units(CFU)per ml(CFU/ml)or per g(CFU/g)of sample.,3.平板菌落计数法,4.液体稀释法,10n,10n-2,10n-1,5.薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,6.干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,7.比浊法,原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,8.生理指标法,测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。蛋白质含量=含氮量*6.25细胞总量=蛋白质总量/65%蛋白质总量*1.54其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,第五节 微生物生长繁殖的控制,1.灭菌（sterilization）杀死所有微生物采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物（包括芽孢和营养体）永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。灭菌后的物体不再有可存活的微生物。商业灭菌（Commercial sterilization）：这是从商品角度对某些食品所提出的灭菌方法。指食品经过杀菌处理后，按照所规定的微生物检验方法，在所检食品中无活的微生物检出，或者仅能检出极少数的非病原微生物，但它们在食品保藏过程中，是不可能进行生长繁殖的，这种灭菌要求就叫做商业灭菌。2.消毒（disinfection）杀死一切病原微生物采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。它可以起到防止感染或传播的作用。具有消毒作用的化学物质称为消毒剂。,3.防腐（antisepsis）利用理化因素抑制微生物生长繁殖利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。它能防止食物腐败或防止其他物质霉变。具有防腐作用的化学物质称为防腐剂。低温缺氧干燥 高渗透压高酸度高醇度 加防腐剂 4.化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。,1、高温灭菌（消毒）法高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,一、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法,（一）温度,干热灭菌法（dry heat sterilization）原理：干热可使细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥，并可使各种细胞成分发生氧化变质焚烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。烘箱内热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温至150170，维持12小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。,湿热法(moist heat sterilization)：即以100以上的加压蒸气进行灭菌。特点：温度低、时间短、灭菌效果高原因：1)菌体内含水量越高，则凝固温度越低；2)蒸汽冷凝会放出潜热；3)饱和水蒸汽穿透力强；4)湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。,高压蒸汽灭菌法利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 以上高温灭菌的方法。方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min。112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,高 压 蒸 汽 灭 菌 锅,注意事项：排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压；灭菌结束，趁热取出物品。,连续加压灭菌法,在发酵行业里也称“连消法”，大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用原理：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。属高温瞬时灭菌条件：135-140下维持5-15s优点：a、提高了原料的利用率和发酵产品的质量和产量；b、提高了发酵罐的利用率；c、提高了锅炉的利用率；d、适宜于自动化操作，降低了操作人员的劳动强度,煮沸消毒法将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。巴斯德消毒法（Pasteurization）：用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒该法一般是将待消毒的液体食品置于62处理30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。低温维持法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min处理牛奶高温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s处理牛奶超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在140左右3-4s，急剧冷却至75，经匀质化后冷却至20。,间歇灭菌法：将待灭菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过程三遍以上。其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽孢，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。缺点是麻烦、费时。,高温对培养基成分的有害影响及其防止：1)有害影响,2)消除措施；a.采用特殊加热灭菌法；分别单独灭菌、低压灭菌、间歇灭菌a)含糖培养基进行灭菌b)含ca2+或Fe3+的培养基c)对含有在高温下易破坏成分的培养基可进行低压灭菌(在112即0.57kgcm2或8磅英寸2下灭菌15分钟)或间歇灭菌；d)在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。,b.过滤除菌法：各种滤器 滤膜过滤装置、烧结玻璃板过滤器、石棉板过滤器、素烧瓷过滤器、硅藻土过滤器缺点：无法去除病毒和噬菌体c.其他方法。避免发生沉淀：EDTA（乙二胺四乙酸）NTA（氮川三乙酸）气体灭菌剂：氧化乙烯,低温低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。冷藏法：5，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜冷冻法：食品工业中采用-10左右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但所需温度更低，如-80低温冰箱、或-78干冰、或-80液氮中冷冻保存。,2、低温抑菌,采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的。但不能除去病毒。实验室中常用的滤器：滤膜过滤器、蔡氏过滤器、玻璃过滤器、磁土过滤器等。过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜；以及石棉板、烧结陶瓷、烧结玻璃等。滤器孔径：常用0.22 m、0.45 m。应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌,（二）过滤除菌法,过滤除菌,微波、可见光、紫外辐射、X射线、射线和电子等微波：（9152450MHz/s）产生热效应，使蛋白质、酶等物质变性，导致微生物死亡。应用：食品消毒、灭菌可见光：（400800nm）太强或连续长时间照射会导致微生物死亡（光氧化作用）。紫外线（):（100 400nm）紫外线作用于DNA,使其产生胸腺嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成微生物变异或死亡。另外会使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧释放的原子氧有杀菌作用。应用：由于穿透力差，只适用于物体表面以及空气、水的消毒杀菌，也用于诱变育种。其中波长在260 280nm处的紫外线杀菌力最强。,（三）辐射,、射线，波长短，能量高，有较强的杀伤力。作用原理：可引起水和其他物质的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分,对所有生物均有杀伤作用。应用：用于杀菌或菌种诱变。,干燥和渗透压对微生物的影响1.干燥对微生物的影响,机理：微生物细胞内蛋白质的变性和盐类等物质浓度提高，从而抑制生长或造成微生物死亡温度：温度高，微生物易死亡干燥速度：干燥速度