微小RNA及其在医学中的应用.ppt
微小RNA及其在医学中的应用,一、微小RNA的发现,人类基因组中，蛋白质编码区只占1-2。其它98的基因组有什么功能呢？约24为内含子序列，这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？,后基因组时代的中心法则,RNA 加工,基因调节,DNA 修复和重组,基因组的保持,基因组的表达,后基因组时代的基因调控：RNA 调控,人类基因组绝大部分被转录成RNA非编码RNA的数量是编码RNA的数百倍生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码RNA内，而非编码序列内。,2006年的诺贝尔生理学奖获得者：,Andrew Z.FireCraig C.Mello,第一个被发现的miRNA(lin-4)由哈佛大学的Victor Ambros 发现的（1993）第二个被发现的miRNA（let-7）由哈佛大学的博士后Frank Slack(Ruvkun 实验室）发现的（2000),Victor Ambros,Gary Ruvkun,微小RNA（microRNA,miRNA）的发现,第一个被发现的miRNA:lin-4,Ruvkun G,Wightman B,Ha I.The 20 years it took to recognize the importance of tiny RNAs.Cell.2004 Jan 23;116(2 Suppl):S93-6.Lee R,Feinbaum R,Ambros V.A short history of a short RNA.Cell.2004 Jan 23;116(2 Suppl):S89-92,近年来被鉴定的miRNAs越来越多 至今超过17000 miRNAs已被发现 可以免费获得 http:/sequences/,二、微小RNA的特点,微小RNA的作用特点,主要是在蛋白质水平调控端-个核苷酸高度保守，主要作用在靶mRNA的端非翻译区（unstranslated region,UTR）分完全和不完全配对两种方式，哺乳动物主要为不完全配对结合，影响mRNA的成熟、转运、稳定性或者在直接调控翻译是翻译抑制还是剪切mRNA，除配对因素外，还取决于RISC中组装元件的功能，如Arg蛋白,小干扰RNA（small interfering RNA;siRNA）和微小RNA的异同点,siRNA和miRNA的相同点,三、微小RNA的主要功能,miRNA,发育增殖(干细胞),疾病,分化凋亡,Victor R.Ambros,秀丽线虫 C.elegans,1.调控发育过程,miR-124a局限表达于神经组织miR-1局限表达于骨骼肌和心肌,青鳉,斑马鱼,小鼠,果蝇,miRNA的表达具有组织特异性,(Science 2004),3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程,2.调控细胞分化,3.miRNAs与心血管疾病,（调控心肌前体细胞的增殖）,4、miRNA 与病毒感染,miRNA与肝炎病毒,HCV,HBV,miRNA,基因表达,信号传导,肝细胞肝癌发生、发展,诊断、治疗,在肝炎模型中发现的肿瘤相关miRNA,HCV,HBV,has-miR-191,Worse survival in acute myeloid leukemia,p53 tumor supressor pathway,has-miR-34,has-let-7a,ras and c-myc genes,has-miR-133b,Sequamous cell carcinoma,has-miR-142-5p,Hematopoietic specific,Normal,5.微小RNA与肿瘤的关系,微小RNA调控癌基因表达,下调miRNA表达，促进了E2F1的表达,Western Blotting,NorternBlotting,有些微小RNA可能是致癌基因,mir-1792高表达,增加mir-1719b的表达，加速了c-myc诱导的淋巴瘤形成,miRNAs与肿瘤的关系,miRNA与疾病关系的研究策略,哪些miRNA表达,miRNA文库筛选,分离,克隆,测序,miRNA表达谱分析,哪些基因是miRNA的靶基因,哪些重要的miRNA影响到 某种生命活动,miRNA在什么时候、在哪里表达,功能分析,治疗,诊断,(一)胃癌概述,胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。中老年发病较多，男女比例约2比1全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。,四、微小RNA与胃癌的关系,(二)目前胃癌诊治的现状,早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约1年。胃癌5年总生存率一般在10%左右。胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如CEA灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物,胃癌组织癌旁组织,总 RNA 提取,定量RT-PCR,miRNA芯片,细胞培养,MGC803,SGC-7901,组织类型 细胞分化 侵润深度 TNM分期 转移,生长曲线MTT 定量PCR检测 细胞周期凋亡检测 靶基因分析,(三)技术路线 临床研究 体外实验 功能分析,反义寡核苷酸阻断miRNA的表达,综合分析确定miRNAs可能的致癌机制,(四)胃癌组织中微小RNA的表达谱,芯片分析胃癌组织中异常表达的微小RNA,Guo J,et al.J Gastroenterol Hepatol.2009,24(4):652-657,19种差异表达的微小RNA 12 7 miR-139-5p，miR-497和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现miR-340*、miR-421和miR-658首次在癌组织中发现高表达,高表达的微小RNA（miR-106a）与胃癌分期的关系,(五)临床病理因素分析结果,Xiao B,Guo J,et al.Clin Chim Acta.2009;400(1-2):97-102.,miR-106a异常表达的临床意义,因素 病例数 变化倍数 P直径 5cm3068.59 258.49 0.001 5cm25 14.65 29.21分化 中 237.36 15.48 0.001 低 2259.62 299.13淋巴结转移+46 50.69 209.88 0.001-910.24 20.52远处转移+9142.35 414.60 0.001-4624.84 107.37侵润 T120.14 0.04 T2266.09 12.72 0.001 T31750.49 173.91=0.005 T410140.69 390.79,实时定量PCR 结果,Jiang C,Guo J,et al.Journal of Gastroenterology.DOI 10.1007/S00535-009-0135-6,癌组织中mir-421的表达明显高于癌旁组织,体外实验结果,合成特异性微小RNA引物、用未转染肿瘤细胞中的对照，比较转染后癌细胞中微小RNA表达的变化,蒋振，郭俊明，等.中国病理生理杂志 2009,25(9):1726-1730.,下调miR-421表达对胃癌细胞生长的影响,Jiang C,Guo J,et al.Journal of Gastroenterology.DOI 10.1007/S00535-009-0135-6,miR-421靶蛋白实验结果,筛选微小RNA匹配度最高的肿瘤相关靶基因、检测靶基因在蛋白质水平上的变化,Jiang C,Guo J，et al.Journal of Gastroenterology.DOI 10.1007/S00535-009-0135-6,胃癌相关微小RNA的功能研究 肿瘤抑制基因Rb和PTEN 分别受到miR-106和miR-21的调控;E2F1受到miR-17-92基因簇调控,免疫组化,RbPTENE2F1,癌旁 癌,Guo J,et al.J Gastroenterol Hepatol.2009,24(4):652-657,结 论,实验显示，miR-421在胃癌中显著高表达，下调miR-421的表达可以抑制胃癌细胞的生长，它可能是一个潜在的胃癌治疗靶点miR-421发生的初期阶段中可能起重要作用,它可能是一个新的胃癌诊断候选标志物 通过临床病例检测，miR-421在肿瘤病人中阳性率为73.33%，阳性率较高优于现在临床胃癌标志物CEA检出灵敏度（仅40%）,
