小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验.ppt

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验,武汉大学基础医学院免疫学教研室熊 洁,原 理（体外法）,巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。本实验拟检测小鼠腹腔巨噬细胞对白色念珠菌的吞噬功能。,材 料,1小白鼠 2白色念珠菌液（美兰染液着色）36可溶性淀粉肉汤 肉汤培养液100 m1，加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌 4小鼠解剖器械、显微镜、离心机、温箱等 5试管、吸管、微量加样器、计数板,方 法,(1)、小鼠巨噬细胞制备 实验前三天每只小鼠腹腔注射1可溶性淀粉1ml。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，新洁尔灭浸泡5分钟。剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)，用1640灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用1640离洗一次。最后沉积细胞用含10小牛血清1640配成适当浓度备用(1-2106ml)。,（2）白色念珠菌制备 将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1108ml菌悬液，4冰箱保存备用。,（3）吞噬细胞与菌混合培养 取巨噬细胞0.5ml加白色念珠菌悬液0.5ml，置37温育30min。取1滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数。,高倍镜下观察计算：吞噬率=(吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数/100个巨噬 细胞)100吞噬指数=100个巨噬细胞中吞噬白色念珠菌总数/100个巨噬细胞*(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞),注 意 事 项,1、菌与细胞混合后充分混匀非常重要。对于此实验，菌与吞噬细胞之比10：1时吞噬作用容易观察和计数。但是吞噬效果好，能真正反映实际情况又可被检测的比例为1：1。,2、菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30 min，如果在37C 条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解，也就不能计数为吞噬了菌的细胞。,3、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使用的吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入的细胞数就相应的少一点。,血球计数板计数法,血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图），每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为0.1mm。因此，每大方格容积为0.1mm3。四角的大方格，又分为16个中方格，适用于白细胞计数。中央大方格以双线等分为25个中方格。每个中方格又分16个小方格，通常我们取四角的4个中方格和中间的1个中方格来计数红细胞。,首先用吸管吸取少许稀释后的单细胞悬液，从盖片端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入，静置数分钟后，再放在微镜下观察计数。计数时，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。计数应重复3次，取其平均值。,数完毕后，依下式计算：每1mL白细胞悬液细胞数（4个中方格细胞总数/4）104 稀释倍数 每1mL红细胞悬液细胞数（80个小方格细胞总数/80）400104 稀释倍数,