饲料添加剂植酸酶产品质量评价规程体外法.docx
饲料添加剂植酸酶产品质量评价规程体外法1范围本标准规定了通过体外法进行饲料添加剂植酸酶产品质量的评价方法。本标准适用于不同固态饲料添加剂植酸酶产品质量进行同批次对比评定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T17890饲料用玉米GB/T20195动物饲料试样的制备3原理以玉米为底物，定量添加饲料添加剂植酸酶产品，通过体外胃蛋白酶-胰蛋白酶体系模拟畜禽消化过程，底物释放的磷能与钮铝酸铁生成黄色的复合物，于40Onm波长下进行比色测定，以单位质量植酸酶产品能释放的植酸磷量确定饲料添加剂植酸酶产品的质量。4试剂或材料本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。试验中所有标准滴定溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T601、GB/T603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时.，均指水溶液。4.1 胃蛋白酶：250U/mgo4.2 胰蛋白酶：2600U/mgo4.3 浓盐酸。4.4 盐酸溶液(0.01molL)：pH2.0,0.31mL盐酸，注入1000InL蒸储水中。4. 5磷酸缓冲溶液(0.1molL)：PH7.6,31.2634gNa2HPOr12H20和2.0286gNaH2PO42比0分别溶解、混合，加水稀释至1000mLo4.6 胃蛋白酶溶液(LOmgmL)：0.1g胃蛋白酶(4.1),溶解于100mL0.01mol/L盐酸溶液(4.4)中，pH=2.Oo4.7 胰蛋白酶溶液(2.5mgmL)：0.25g胰酶(4.2),溶解于100mL0.1mol/L磷酸缓冲溶液(4.5)中，使用前半小时配制。4.8 氢氧化钠溶液(1.0mol/L)：4gNaOH,溶解于100InL蒸储水中。4.9 TriS-HCL缓冲液：pH7.6。4.10 磷标准储备液（50ugmL）：取105干燥至恒重的磷酸二氢钾，准确称取0.2195g，溶解于水，移入1000mL容量瓶中，加硝酸3血“加水稀释至刻度，摇匀，即得。置聚乙烯瓶中4下可储存1个月。4.11 钢相酸铉显色剂：称取偏机酸铉1.25g,加水200矶加热溶解，冷却后再加入250mL硝酸，另称取钳酸铉25g,加水40OmL加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水稀释至1000mL,避光保存，若生成沉淀，则不能继续使用。4.12 透析袋：截留分子量12OoO14000D,使用前以蒸储水煮沸10min,清洗干净，于4°C蒸锵水中浸泡存放，90天内可用。5仪器设备5. 1分析天平：感量0.0001go5. 2高速粉碎机：转速不低于24000rpm.5.6 鼓风干燥箱：RT+10200,精度±0.5<,5.7 水浴恒温振荡器：RT+5100,精度±0.55.8 紫外-可见分光光度计：带1Cm光径比色皿。5.9 酸度计：PH精确至0.01。5.10 高温电炉。6样品5.11 饲料添加剂植酸酶按GB/T14699.1的规定进行采样，选取有代表性的样品，用四分法将试样缩分至IoOg,按照GB/T20195制备样品，密封、避光、25以下处保存。5.12 玉米6. 2.1空XX米用作底物的玉米应符合GB/T17890一级饲料用玉米的要求。将玉米样品105烘至恒重,回潮，粉碎，过60目筛，密封保存。7. 2.2添加植酸酶玉米取6.2.1制备好的空XX米试样，每千克添加0.2g饲料添加剂植酸酶产品，充分混匀，密封保存。7试验步骤7.1 标准工作曲线绘制准确移取磷标准储备液（4.10）0mL>1mL>2mL、5mL、10矶、15mL于50mL容量瓶中（即相当于含磷量为0ug、50ug、100ug、250ug、500ug、750ug）,于各容量瓶中分别加入锐铝酸镂显色剂（4.11）10mL,用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置IOmin以上，以OmL磷标准溶液为参比，用1Cm光径比色皿，于40Onm波长下测定各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线或计算回归方程。7.2 试样测定7.2.1 准确称取添加植酸酶玉米样品（6.2.2）1g（精确至0.0001g）,同时准确称取等量的空XX米试样用作空白试验。分别置于20mL一次性注射器中，各加入1.0mg/mL的胃蛋白醐溶液（4.6）IOmL,密封，置于水浴恒温振荡器中，37C.180rmin,消化90min。加入Lomol/L氢氧化钠溶液（4.8）0.1矶中和后，再加入2.5mg/mL胰蛋臼醐溶液（4.7）10mL,混合均匀，无损转入透析袋（4.12）,封口。7.2.2将透析袋放入装有200矶TriSTICL缓冲液（4.9）的烧杯中，置于水浴恒温振荡器中，37、180rmin,消化120min。7.2.3取出烧杯，静置，取20面,消化后上清液，置于15OmL三角瓶中，加入2mL浓盐酸（4.3）,高温电炉消煮，直至澄清透明，放置至室温后，以氢氧化钠溶液（4.8）调PH值至7.6o7.2.4使用中速定量滤纸过滤至50ml,容量瓶中，并以蒸储水清洗滤纸两次，合并滤液，加入10mL饥钳酸较显色剂（4.11）,以去离子水定容至刻度，摇匀得到试样溶液。7.2.5试样溶液室温放置10min后，用ICm光径比色皿在400nm波长下测定试样溶液的吸光度，通过工作曲线查出或回归方程计算试样溶液的磷含量。若试样溶液磷含量超过磷标准工作曲线范围，应对试样溶液进行稀释。8试验数据处理单位质量的植酸陋产品释放底物中植酸磷的量以质量分数P计,数值以微克每克（Ugg）表示，按公式（1）计算：（r11-m2）×200.m×0.2（叫-m?）X50000P（Ug/g）;-20-1000=-in-式中：m试样质量，单位为克（g）:如一从标准工作曲线计算得到的试样溶液中磷的含量，单位为微克（IIg）;侬从标准工作曲线计算得到的空白试样溶液中磷的含量，单位为微克（Ug）；200一一试样消化液的总体积，单位为毫升（mL）；20移取试样消化液的体积，单位为毫升（mL）O9精密度在重复性条件下，两次独立测XX果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的10虬
