甜菜碱对大鼠肝癌的作用及其抗氧化机制的探讨.docx

甜菜碱对大鼠肝癌的作用及其抗氧化机制的探讨杜艳平，区俊文，王军花，习文韬，唐艳辉(广州中医药大学祈福医院营养科，广东广州510000)摘要目的探讨甜菜碱(Bet)在二乙基亚硝胺(DEN)致大鼠肝癌过程中对肝脏病理损伤及肝功能的影响，并从抗氧化作用探讨其机制。方法在0.01%DEN诱导大鼠肝癌过程中，用1%Bet进行干预，观察大鼠一般情况。肝脏切片用HE染色观察病理改变；全自动生化分析仪检测肝功能相关酶ALT、AST、ALP、GGTo测定肝匀浆丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽硫转移酶(GST)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、以及总抗氧化能力(T-AC)C).结果从第2周开始，DEN组和DEN+1%B组大鼠体重低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；病理结果显示DEN+1%B组肝脏癌变程度比DEN组轻；给予DEN的2个组大鼠肝脏功能均受损，但给予DEN+1%B组较轻(P<0.05),差异有统计学意义；第8周DEN组MDA含量及GST酶活性均高于正常组(P<0,05),而DEN+1%B组MDA含量低于DEN组(P<0.05),差异均有统计学意义；第15周各组间脂质过氧化与抗氧化指标的差异均无统计学意义(P>0.05)O结论l%Bet能够减弱DEN对大鼠肝脏的诱癌效应，具有抗脂质过氧化能力，在DEN致大鼠肝癌过程中起到一定作用。关键词甜菜碱；肝癌；脂质过氧化Effectsofbetaineonlivercancerofratanditsantioxidation.DUYan-Ping,OUJun-Wen,WANGJun-Hua,XIWen-Tao,TANGYan-Hui.NutritionalDepartment,CliffordHospital,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,No.3.HongfuRoad,PanyuDistrict,Guangzhou511495,China(Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofbetaine(Bet)onpathologydamageofliverandliverfunction,andinvestigatethemechanismfromitsantioxidationtoliverintheprocedureofdiethylnitrosamine(DEN)inducinglivercancerofrats.MethodsIntheprocessof0.01%DENinducedhepatocellularcarcinomainrats,1%BETwasusedtointervene,andthegeneralconditionofratswasobserved.HepaticsectionswerestainedwithHEtoobservethepathologicalchanges.LiverfunctionrelatedenzymesALT,AST,ALPandGGTweredetectedbyautomaticbiochemicalanalyzer.Thecontentsofmalondialdehyde(MDA),theactivitiesofglutathionethiotransferase(GST)andsuperoxidedismutase(SOD),andthetotalantioxidantcapacity(T-AOC)ofliverhomogenateweredetermined.ResultsFromweek2,thebodyweightofratsintheDENgroupandtheDEN+Betgroupwaslowerthanthatinnormalgroup,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).ThedegreeoflivercancerinDEN+l%BetgroupwaslessthanthatinDENgroup.Atweek8,MDAcontentandGSTactivityintheDENgroupwerehigherthanthoseinthenormalgroup(PVO.05),whileMDAcontentinDEN÷BetgroupwaslowerthanthatintheDENgroup(PVQO5),thedifferenceswerestatisticallysignificant.Atweek15,therewerenosignificantdifferencesinlipidperoxidationandantioxidantindexesamongallgroups(P>0.05).Conclusion1%betainecanattenuateeffectsofDENinducinglivercancerandprotectliveragainstlipidperoxidation,soitplayssomerolesinthedevelopmentoflivercancerofratinducedbyDEN.KeyWords：betaine;livercancer;lipidperoxidation原发性肝癌(PrimaryhePatiCCarCinoma,PHC,以下简称肝癌)严重威胁我国居民身体健康，是我国排名第四位的常见恶性肿瘤。肝癌死亡率高，在我国恶性肿瘤中死亡顺位仅次于胃癌和食道癌而居第三位。肝癌的形成是一个多因素的复杂过程，发病过程隐匿，不利于早期防治。甜菜碱(Betaine)是季胺盐型水溶性生物碱，具有多种生物学功能，可以降低毒物所导致的肝脏毒性，改善肝脏脂质过氧化状态，对肝脏起到保护作用，这在一定程度上可减弱外来化合物诱发肝癌的效应但)。为探讨甜菜碱在肝癌发生过程的作用，本研究以SPraggDaWley(SD)大鼠为研究对象，二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠产生肝癌，并用不同剂量的甜菜碱进行干预，以观察甜菜碱对肝癌形成的影响，并探讨可能的机制。1材料与方法1.1 动物受试物及试剂甜菜碱（纯度96%）,购自FinnfeedsFinlandLtd（芬兰）公司；DEN（纯度95%）,购自Sigma公司；血清肝功能相关前所用试剂购自中生北控生物技术股份有限公司；肝匀浆脂质过氧化及抗氧化指标所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.2 实验动物及处理44只SPF级健康雄性SD大鼠，体重150±10（g）,购自广东省医学动物实验中心（合格证号：）。适应环境3天后进入实验，将大鼠按照体重编号后采用完全随机与分层随机相结合的方法分为5个组：正常组12只、DEN组18只、DEN+甜菜碱组（DEN+1%B组）14只。正常组、DEN组给予AIN-93G基础饲料，在基础饲料基础上，甜菜碱干预剂量参考既往研究，DEN+Bet组添加1%甜菜碱。所有大鼠代谢笼饲养，自由摄食饮水，除正常组外，其余4组均给予0.01%DEN水置于避光饮水瓶中任其自由饮用。在第8周各组随机选取5只大鼠股动脉取血后脱臼处死，取肝、脾、肺、肾，称重后-80C保存。DEN组在实验第14周和15周各随机选取2只大鼠处死以观察肝癌形成情况，第15周末肝癌出现时处死所有大鼠。1.3 指标测定1.3.1 肝脏病理切片的制备对已发生肝癌的大鼠取肝结节及周围组织，没发生肝癌大鼠取右1/4肝上叶，10%中性福尔马林固定，经脱水、透明、浸蜡、常规石蜡包埋、制备成5um左右的切片，苏木素伊红（HE）染色，进行常规组织学检查。1.3.2 血清肝功能相关酶测定全自动生化分析仪检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）.碱性磷酸酶（ALP）.y-谷氨酰转移酶（GGT）。1.3.3 肝匀浆脂质过氧化及抗氧化指标的测定称取0.5克肝脏，转移至预冷的玻璃匀浆器中，加9倍（4.5ml）冰冷的生理盐水,冰上将肝脏研磨至10%匀浆,40OOg离心20分钟,取上清,分装后-20保存待测。按试剂盒方法分别测定丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽硫转移成(GST)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、以及总抗氧化能力(T-AOC),考马斯亮蓝法测定肝匀浆蛋白质含量。1.4 统计分析SPSS22.0软件建立数据库，结果以均数士标准差G±s)表示，采用单因素方差分析(One-WayANoVA)及LSD检验进行统计分析，检验水准设为0.05。2结果2.1 实验动物一般状况给予DEN的2个组大鼠从第2周开始体重低于正常组；第4周之后逐渐出现被毛蓬松污秽、毛色黯淡，眼睛无神，精神萎靡，拱背等变化；DEN+1%B组上述症状比DEN组轻。DEN+1%B组第15周有一只大鼠死亡，解剖发现肝癌结节有破裂。对各组不同周次的大鼠体重进行方差分析及LSD检验，有图1可见，从第2周开始DEN组、DEN+Bet组体重低于正常组(P<0.05),而这两个组之间差异无统计学意义(P>0.05)。注：曲线上,表示正常组与其他组相比，P<0.05,差异有统计学意义图1各组大鼠体重变化曲线图2.2 各组大鼠的脏器指数表1可见，DEN组在第8周及第15周均有多个脏器指数升高(P<0.05),而DEN+1%B组只在第8周出现肺脏指数升高(P<0.05)0表1各组不同时间的脏器指数（X±s,g100g）周次组别肝脏指数脾脏指数肺脏指数肾脏指数正常组（n=5）2.530±0.1910.150+0.0320.416±0.0380.650+0.021DEN组(n=5)2.519±0.0940.206+0.0350.836±0.206”0.789+0.161*8wDEN+1%B组(n=5)2.204±0.1930.202±0.0440.854±0.29140.612÷0.027F值2.2923.5617.92612.56P值0.1440.0610.0060.001正常组（n=7）2.148±0.1800.157±0.0240.371±0.1030.551+0.024DEN组(n=9)3.506÷0.5110.219±0.035*1.417±0.907'0.614±0.10715wDEN+1%B组(n=8)2.485+0.4440.184÷0.0240.734±0.2510.584+0.026F值13.595.67015.330.308P值0.0010.018<0.0010.740注：同一时间数值旁*表示与正常相比，P<0.05,差异有统计学意义2.3 大鼠肝脏形态学观察大体观（见图1）：第8周DEN+1%B组肝脏肉眼观无明显变化，DEN组肝脏肿大，表面粗糙暗淡、部分可见灰白色点状斑点；第15周给予DEN的2个组所有大鼠均有灰白色或灰黄色结节出现，但结节病变程度并不相同，DEN组肝脏多出现弥漫性大结节（直径多为5mm左右），DEN+1%B组结节较小（直径Imm左右）、个数也比DEN组少。镜下观（见图2）：第8周DEN+1%B组肝细胞结构轻微破坏，出现部分肝细胞肥大增生、少量空泡变性；DEN组肝细胞明显空泡变性，局灶性坏死,纤维组织增生。第15周DEN+1%B组肝细胞核增大，染色质深染，呈现不典型增生；DEN组肝小叶结构完全破坏，结节内肝细胞异型性增生明显，胞质染色不均匀，核大，核仁清楚，核分裂像多见。DEN+1%B组DEN组图1大鼠肝脏大体观正常组DEN+1%B组DEN组图2大鼠肝脏镜下观（10×40倍）2.4甜菜碱在DEN致大鼠肝癌过程中对血清肝功能相关酶的影响血清GGT含量呈非正态分布，对数据进行秩转换，转换后数据呈正态分布、方差齐。对ALT、AST、ALP及GGT秩次进行统计分析。由表2可知，DEN组无论在第8周还是第15周血清肝功能相关酶均高于正常组（P<0.05）；DEN+1%B组在第8周及第15周AST均低于DEN组（P<0,05）；DEN+1%B组第15周ALT低于DEN组（P<0,05）。表2各组血清肝功能相关能含量丘±s）周次组别AE(UL)AST(UZL)ALP(UZL)GGT（秩次）正常组（n=5）24.00±2.12197.60±12.09120.80±10.477.40±3.58DEN组(n=5)37.50±1.91*247.00+15.16*219.50±22.28*27.10±7.25s8wDEN+l%B(n=5)30.80÷4.32196.00±11.87a210.60±19.60ts23.30±9.90*F值4.0645.70041.135.048P值0.0450.018<0.0010.026正常组（n=7）28.50±3.08215.17±17.88126.67±I5.86ll.42±5.92DEN组(n=9)60.14±11.47*29l.00±24.48*232.86+14.33,41.57+14.38*15wDEN+B(n=8)41.33±4.55*235.33±19.12a233.67土19.15"32.67±13.744F值39.464.91819.164.229P值<0.0010.028<0.0010.041注：同一时间数值旁*表示与正常相比，P<0.05,差异有统计学意义；表示与DEN组相比，P<0.05,差异有统计学意义2.5甜菜碱在DEN致大鼠肝癌过程中对肝脏脂质过氧化及抗氧化功能的影响由表3可知，第8周DEN组MDA含量及GST酶活性均高于正常组（P<0.05）,而DEN+1%B组MDA含量低于DEN组（P<0.05）°第15周各组间各指标的差异均无统计学意义（P>0.05）。表3各组肝匀浆脂质过氧化及抗氧化指标周次组别MDA含量nmol/mgprotSOD酶活性UZmgprotGST酶活性UZmgprotT-AOCUZmgprot正常组（n=5）0.166÷0.055170.09+33.9327.37÷2.630.269±0.089DEN组(n=5)0.357+0.152*164.98+56.9138.62±2.55*0.609±0.2488wDEN+Bei组(n=5)0.145±0.068a190.86+55.3231.36+3.100.516+0.201F值20.180.8998.163.667P值<0.0010.4330.0060.05715w正常组（n=7）0.236±0.088167.70±44.0127.79±6.730.363±0.096DEN组(n=9)0.299+0.087150.44+57.5929.29±4.230.912+0.290DEN+Bel组(n=8)0.222+0.032161.79+40.1326.41±3.460.564÷0.184F值2.7990.5300.1523.260P值0.1010.6020.8610.074注：同一时间数值旁*表示与正常相比，P<0.05,差异有统计学意义；表示与DEN组相比，PVo.05,差异有统计学意义3讨论DEN是一种对动物有较强致癌作用的化学物，在自然界中广泛存在，在机体内代谢时发挥其致癌作用。经口摄入DEN可导致严重的肝损伤，并最终形成肝癌，与人类肝癌有相似的发病轨迹。本研究以0.01%DEN通过长期饮水法诱发大鼠肝脏癌变。第15周末实验结束时，经病理检查证实模型组全部出现肝癌，说明造模成功。肝癌形成之后，肝结节的破裂易导致大鼠死亡，第15周DEN+1%B组死亡1只大鼠。DEN在诱导大鼠肝癌形成过程中，肝细胞遭到严重破坏，导致DEN组血清ALT、AST、ALP、GGT均明显升高，这与以往的研究结果相一致网。甜菜碱是甘氨酸的三甲基衍生物，主要通过食物摄入，对肝脏具有一定的保护作用，可减弱酒精、脂多糖、四氯化碳等所导致的肝脏毒性。越来越多证据表明，甜菜碱可能对癌症有保护作用，甜菜碱的摄入可降低癌症发病率，但需要进一步的研究来验证这一结果。本研究结果也表明，1%甜菜碱对DEN引起的肝脏损伤起到一定的保护作用。有证据表明，甜菜碱在多种疾病中具有抗炎作用，可改善含硫氨基酸的代谢来应对机体的脂质过氧化。机体正常代谢过程中能够维持体内脂质过氧化和抗氧化系统的动态平衡，当机体处于病理状态时，平衡破坏，过多的自由基堆积并夺取细胞膜不饱和脂肪酸侧链上的氢原子而启动脂质过氧化链式反应，产生过多的MDA等醛类代谢产物而损伤细胞结构，引起蛋白质交联变性、DNA损伤而促进肿瘤的形成。研究发现，甜菜碱可减少MDA等脂质过氧化物，并提高SOD、GST等抗氧化产物浓度，以减少DEN对肝脏的损伤叼。本研究中DEN+1%B组MDA含量低于DEN组，提示1%甜菜碱可减少体内脂质过氧化产物以减轻DEN对肝脏所致的损伤，在DEN诱发大鼠肝癌的过程中起到保护肝脏的作用。但随着干预周期的增加，由于DEN在致癌过程中严重损伤了肝脏的代谢能力，甜菜碱并不能在肝脏充分代谢以发挥其抗脂质过氧化作用，这可能是第15周DEN+1%B组不能改善肝脏MDA含量的原因。GST是一类与解毒功能有关的酶，当机体受到DEN等化学致癌物的影响时，GST酶活性代偿性增高，以此来代谢化学致癌物。肝脏癌前病变时肝细胞膜的通透性增加，GST释放到肝细胞外，导致肝匀浆中GST浓度增多、酶活性升高阴。第8周的实验结果提示在一定程度上，肝匀浆中GST酶活性升高情况与肝脏损伤状况有关。第15周各组间GST酶活性无统计学意义，这可能是因为在DEN致大鼠肝癌的过程中，随着肝脏病变程度的加重，机体代偿能力降低，已不能再通过提高GST酶活性来增强其解毒能力。本研究中各组间T-AOC和SOD酶活性的差别无统计学意义，可能是因为肝脏通过多种因素进行调节脂质过氧化与抗氧化系统，从而保持T-AC)C、SOD在正常水平。第15周各组间各指标差异均无统计学意义，这提示脂质过氧化与抗氧化系统失衡在肝癌发生早期起重要作用，但随着癌变程度的加重，肝脏脂质过氧化与抗氧化系统在一定程度上不再变化，具体机制还有待于更深入的研究。本研究通过成功运用DEN诱发大鼠肝癌模型，重点从甜菜碱的抗氧化功能探讨了其在大鼠肝癌发生过程中的作用及机制。结果表明，1%甜菜碱的抗氧化作用能够减弱DEN对大鼠肝脏的损伤，在DEN致大鼠肝癌过程中起到一定的保护作用。参考文献1 XiaoJ,WangF,WongNK,etalGloballiverdiseaseburdensandresearchtrends:AnalysisfromaChineseperspectiveJ.JHepatol,2019,71(1):212-221.2 DayCR,KempsonSA.Betainechemistry,roles,andpotentialuseinHverdiseaseJ.BiochimBiophysActa.2016,1860(6):1098-1106.3 HagarH,HusainS,FaddaLM,etal.InhibitionofNF-kappaBandtheoxidativestress-dependentcaspase-3apoptoticpathwaybybetainesupplementationattenuateshepaticinjurymediatedbycisplatininratsJ.PharmacolRep,2019,71(6):1025-1033.4 BaSaran-KiiqUkgerginC,BingiilI,TekkeSiaMS,etal.Effectsofcarnosine,taurine,andbetainepretreatmentsondiethylnitrosamine-inducedoxidativestressandtissueinjuryinratIiVerJ.ToxicolIndHealth,2016,32(8):1405-1413.5 TolbaR,KrausT,LiedtkeC,etal.Diethylnitrosamine(DEN)-inducedcarcinogenicliverinjuryinmiceJ.LabAnim,2015,49(1Suppl):59-69.6 ZhangC,ChenY,ZhangM,etal.Vicenin-2TreatmentAttenuatedtheDiethylnitrosamine-InducedLiverCarcinomaandOxidativeStressthroughIncreasedApoptoticProteinExpressioninExperimentalRatslJ.JEnvironPatholToxicolOncol,2020,39(2):113-123.7 SunS,LiX,RenA,etal.Cholineandbetaineconsumptionlowerscancerrisk:ameta-analysisofepidemiologicstudiesJ.SciRep,2016,19,6:35547.8金芳多，张天，张钊，等.芦丁对肝细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制J.吉林大学学报(医学版),2020,46(6):1117-1123.9陆苑，潘洁，杨淑婷，等.艾迪注射液对肝癌大鼠谷胱甘肽-S.转移酶的影响.中国药理学通报,2018,34(8):1170-1174.