实验八微生物生理生化试验.ppt
实验八 微生物生理生化试验,1 菌种 大肠杆菌，普通变形杆菌，金黄色葡萄球菌，产气肠杆菌2 培养基 尿素琼脂试管，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，葡萄糖发酵管和乳糖发酵管各3支。3 溶液和试剂 甲基红指示剂，5萘酚，乙醚和吲哚试剂4 仪器和其他用品 接种针,一 实验器材,二 目的要求1 大分子物质水解试验（1）证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；（2）掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。2 IMViC试验了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。3 糖发酵试验（1）了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用。（2）掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。,三 基本原理1 大分子物质水解试验 微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌对大分子的淀粉不能直接利用，产生胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，这一过程可以用碘测定不再产生蓝色来证明；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH，其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而在25以上明胶会液化。有些微生物能产生明胶酶，水解明胶蛋白，而使明胶液化，甚至在4 仍能保持液化状态。,有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，石蕊牛奶培养基由脱脂牛奶和石蕊配制而成，是昏浊的蓝色，酪素水解成氨基酸和肽后，培养基会变成透明。石蕊牛奶也用于检测乳糖发酵，在酸存在下，石蕊会转变成粉红色，过量的酸可引起牛奶的固化（凝乳形成），氨基酸的分解会引起碱性反应，石蕊变为紫色。某些细菌能还原石蕊，使试管底部变为白色。尿素酶能分解尿素释放氨。尿素琼脂含有尿素、葡萄糖和酚红，酚红在pH6.8时为黄色，在培养过程中，产尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，培养基的pH升高，在pH8.4时，指示剂转变为深粉红色。尽管许多微生物都可以产生尿素酶，但是利用尿素的速度比变形杆菌属的细菌要慢，因此尿素酶实验被用于从其它非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个属的成员。,2 IMViC（吲哚、甲基红、伏普和柠檬酸盐）试验 这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。吲哚试验是用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚（红色化合物）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。,甲基红试验是用来检测有葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红由橙黄色（pH6.3）转变为红色（pH4.2），即甲基红反应。利用该试验可区分大肠杆菌和产气肠杆菌。这两个细菌在培养早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH大约升至6。因此，此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。大肠杆菌为阳性（红色），产气肠杆菌为阴性（黄色）。,伏普试验用于测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的呱基作用，生成红色化合物，即伏普试验阳性，不产生红色化合物为反应阴性。产气肠杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。硫化氢试验也是检查肠道细菌的生化试验。硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐等形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物，为硫化氢试验阳性，可用于鉴别细菌。产气肠杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。,3 糖发酵试验 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因此不同细菌在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。比如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸产气，普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。糖发酵管含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由发酵管中有无气泡来证明。,四、操作步骤（一）大分子物质水解试验1 明胶水解试验（1）取3支明胶培养基试管，用记号笔表面各管欲接种的菌名。（2）用接种针分别穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。（3）将接种后的试管置20 培养25 d。（4）观察明胶液化情况。,2 石蕊牛奶试验（1）取2支石蕊牛奶培养基试管，用记号笔表面各管欲接种的菌名。（2）用接种针分别穿刺接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。（3）将接种后的试管置35 培养2448h。（4）观察培养基颜色变化。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，而被还原时为白色。3 尿素试验（1）取2支尿素培养基试管，用记号笔表面各管欲接种的菌名。（2）分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌（两种细菌对尿素的分解速度不同），需要观察2次。（3）将接种后的试管置35 培养2448h。（4）观察培养基颜色变化。尿素酶存在时为红色，无尿素酶时为黄色。,（二）IMViC试验1 接种与培养（1）用接种针将大肠杆菌和产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中（硫化氢试验），置37培养48 h。（2）将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和伏普试验），置37培养48 h。2 结果观察（1）硫化氢试验：培养48 h后，观察黑色硫化铅的产生。（2）甲基红试验：培养48 h后，葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色为阳性，变为黄色为阴性。（3）伏普试验：葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲液，然后加入等量的乙液，用力振荡，置371530 min,加快反应速度，培养物呈红色者，为伏普试验阳性。,（三）糖发酵试验1 在发酵管上标明所接种的细菌名称。2 取葡萄糖发酵管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接 种，作为对照，另取乳糖发酵管3支，同样操作。3 将接种和对照的发酵管置37 培养2448h。4 观察发酵管的颜色和有无气泡。,各试验需接种的菌种:（1）明胶水解试验：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 20 25 d（2）石蕊牛奶试验：普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌 35 2448 h（3）尿素试验：普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌 35 2448 h（4）糖发酵试验：葡萄糖发酵管和乳糖发酵管：大肠杆菌、普通变形杆菌 37 2448 h（5）硫化氢、甲基红（葡萄糖蛋白胨水）和伏普试验（葡萄糖蛋白胨水）：大肠杆菌、产气肠杆菌 37 48 h,各试验结果判定：（1）明胶水解试验：明胶液化（），明胶不液化（）（2）石蕊牛奶试验：酸性条件下粉红色，碱性条件下紫色，被还原时白色。（3）尿素试验：红色为尿素酶阳性，黄色为尿素酶阴性 葡萄球菌分解较慢，普通变形杆菌分解较快（4）糖发酵试验：产酸为黄色,（）普通变形杆菌，分解葡糖产酸产气，不分解乳糖；大肠杆菌分解乳糖和葡糖产 酸产气（5）硫化氢：培养基黑色为H2S阳性 大肠杆菌阴性，产气肠杆菌阳性（6）甲基红:加入甲基红试剂，红色为阳性，黄色为阴性 大肠杆菌阳性，产气肠杆菌阴性（7）伏普试验：先加甲液，再加等量乙液，用力振荡，37温箱中保 温1530 min。红色为阳性，大肠杆菌阴性，产气肠杆菌阳性,思考题,1.为什么尿素实验可用于鉴定变性杆菌属细菌？2.加入某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？3.为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，儿产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏-普实验最初底物和最终产物有何异同？为什么会出现不同？4.说明在硫化氢试验中醋酸铅的作用，可以用哪些化合物代替醋酸铅？,
