实验五过氧化物同工酶PAGE分析.ppt

实 验 五 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析,（P98）,一、目的,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术的原理和操作方法掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理和方法,二、原理,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）过氧化物同工酶及活性染色,（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）P20,1.电泳概念电泳：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极移动的现象。,+,+,-,+,-,（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,2.电泳分类显微电泳自由界面电泳区带电泳纸电泳醋酸薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,3.电泳法原理 在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素：颗粒性质：净电荷数目颗粒大小颗粒形状电场强度：V/cm溶液性质：缓冲液的pH离子强度溶液黏度电渗：液体对固体支持物的相对移动,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE),（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,4.聚丙烯酰胺凝胶电泳,反应过程,TEMED催化AP生成硫酸自由基 S2O82 2SO4硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：,Bis将单体长链间连成网状结构：,PAGE法分离蛋白质的三种效应,电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场中泳动率不同；分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率也不相同；浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应）,（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）,同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构及其理化性质不同的一组酶。同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。,本实验采用PAGE技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。,过氧化物+过氧化物酶 复合物复合物+DH2 过氧化物酶+H2O+D,H2O2,联苯胺,棕色物质,（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）,三、材料、仪器和试剂,材料：小麦幼苗仪器：电泳仪、电泳槽、高速离心机、量筒、烧杯、微量注射器、研钵、染色盒,三、材料、仪器和试剂,试剂：A液：30%Acr-0.8%BisB液：Tris+EDTAC液：TEMEDD液：10%AP电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3）0.5%溴酚蓝染色液：0.1%联苯胺样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液40%蔗糖溶液,四、操作步骤,凝胶制备 聚丙烯酰胺凝胶配方 成分 含量 作用 A液（30%Acr-0.8%Bis）2.65mL 交联剂 B液（Tris+EDTA）4.75mL 缓冲液 C液（TEMED）10L 加速剂 D液（10%AP）50L 催化剂,四、操作步骤,样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液，以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝，即为样品液。,四、操作步骤,装槽、上样,30-50L,四、操作步骤,电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。,四、操作步骤,剥胶、染色 电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置于染色盒中，进行染色反应，染色10min，用蒸馏水漂洗1-2次。,五、结果与分析,结果,分析 过氧化物同工酶的种类及活力大小,电泳图或模式图,实验注意事项心得收获,六、讨论与心得,