实验五离子交换柱层析法分离氨基酸.ppt
实验六离子交换柱层析法分离氨基酸,目的要求（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。（2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。,一、原理,离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。,带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。,离子交换过程示意：起始 吸附 解吸 完成 x+:起始缓冲离子 y+：待分离离子 z+：待分离离子,二、离子交换剂的种类,在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换,（二）按载体种类不同1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯乙烯+二乙烯苯 聚苯乙烯（单体）（交联剂）二乙烯苯交联度=100%苯乙烯+二乙烯苯,交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性。,目数：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为20-50目Dowex 20 840m 50 297m 100 149m（代表二乙烯苯的百分含量）,树脂resin（据所含交换基团的性质分）阳离子交换树脂 强酸型 含磺酸基团(R-SO3H)中等酸型 含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型 含酚基、羧基阴离子交换树脂 强碱 含季胺基团-N+(CH3)3 弱碱 含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。,2.离子交换纤维素阴离子交换纤维素 如:DEAE-纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基阳离子交换纤维素如:CM-纤维素 一般pH4条件下使用,具有羧甲基,3.离子交换凝胶 分离大分子物质如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose）,三、操作注意点,（一）离子交换剂的选择原则：根据被分离物质的性质选择同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异大的型号交换剂，以保证通过离子交换层析后能得到比较满意的结果。,考虑因素：1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量,根据分离过程的实验条件 强酸强碱应用广泛 弱酸型只能在碱性pH范围内使用 弱碱型只能在酸性pH范围内使用,（二）缓冲液的选择原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性,(三)洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱,四、应用,分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子,离子交换层析法分离氨基酸及测定,原理,所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液，分别属酸性氨基酸(pI2.77)、碱性氨基酸(pI9.74)，在缓冲溶液中分别带正电荷和负电荷，与强酸型阳离子交换树脂Dowex50亲和力有很大不同，在一定的洗脱条件下洗脱，将它们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物进行氨基酸鉴定。,紫色物质，用于氨基酸的比色测定和纸层析显色,与水含茚三酮的反应：,Asp LyspH4.2pH 10,器材,1.层析柱等2.沸水浴,试剂,Dowex50 2mol/L NaOHpH5.3柠檬酸缓冲液样品液：氨基酸混合液茚三酮混合液,实验步骤1树脂的处理 将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。2装柱 取直径1cm,长度1012cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8 10cm的高度即可。装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。,3平衡 将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留34cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。4.加样 揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面12mm关闭出口，沿管壁四周小心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液至液面高34cm左右，接恒流泵。5.洗脱 以缓冲液洗脱，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集6080管。,6洗脱及氨基酸的鉴定 向各管收集液中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热5min后冷却至室温，再加入3mL的0.1%硫酸铜溶液。混匀，以收集液第2管为空白，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线。,实验结果 根据氨基酸的解离性质，分析该实验条件下氨基酸从层析柱洗脱下来的顺序。,Separation of amino acids on a cation exchange column,注意事项 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液 面在树脂表面以下等现象发生。,再见！,
