实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质.ppt

实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质,掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用,实验目的,聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。,实验原理,由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。Bis：交联剂 过硫酸铵(AP)：引发剂，提供自由基，引发聚合反应 四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂,加快引发 释放自由基的速度,聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应：,1.浓缩效应,分离机制：,凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径,pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7；分离胶pH=8.9,缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)；凝胶中 Cl-(快离子)；Pr-介于二者之间,电位梯度不连续,有效迁移率=迁移率 解离度,电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩,2.分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率3.电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。,实验仪器及试剂,电泳装置,稳压电源,盘状电泳槽,毛细滴管,刻度吸量管,灯泡瓶,玻璃管和橡胶帽,微量移液器,注射器和长针头,脱色摇床,TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。过硫酸铵(新鲜配制)染色液：0.1溴酚兰液 洗脱液：7醋酸 其他试剂：见下表贮存液的配制。,Acr和Bis：棕色瓶保存,实验步骤,1.每人取电泳管1支，加1滴40蔗糖于橡胶帽内，堵住电泳管底部，塞紧。2.制备分离胶：（可灌胶12支）1号2ml2号4ml水2ml,在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡；,加3号8ml，混匀备用,最后加,用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口2cm处，然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm高的水层，垂直静置至再次出现界面时表明凝胶已经聚合。,3.分离胶的灌制,4.制备浓缩胶：（可灌胶12支）4号 1ml5号 2ml6号 4ml,在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡；,加3号1ml，混匀备用,最后加,5.吸去分离胶上层的水，灌浓缩胶于分离胶上，高约1.5cm，然后沿管壁小心加入蒸馏水高约0.5cm。垂直放置至成胶。,6.成胶后，吸干上层覆盖水；拔去玻棒塞，吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气。,7.样品制备,血清：1-2滴40%蔗糖：1滴0.05%溴酚兰：1滴,于EP管中混匀备用,倒入上槽缓冲液盖过玻管上端，排出管内的空气，检查有无漏液。用微量加样器吸样品液30ul，加在浓缩胶上。,8.上样,9.电泳,上槽负极；下槽正极,稳流：1.5mA/管，3min 2.5mA/管，约1h，至玻管3/4处,10.剥胶,电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。,11.固定和染色,用7%醋酸固定3min；用0.1%溴酚蓝碱性液染色5min（染色液回收）；用洗脱液(7%醋酸)漂洗脱色,12.观察结果，描出血清电泳区带图谱，分析有无异常,实验结果,+,丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。注意观察实验现象：分界面，浓缩效应.溴酚蓝染色脱色染液回收。固体胶切忌倒入水池。,注意事项,思考题,1.圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高？2.圆盘电泳灌胶时表面要加盖一层水，为什么？,