实验三单向琼脂扩散实验.ppt

单向琼脂扩散实验,江南大学微生物与免疫学实验室,教学对象：强化班学生实验课时：3学时课程类型：专业实验课课程要求：必修每组人数：4人,实验目的与要求,掌握单向琼脂扩散试验的原理、结果分析及应用,实验原理：将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，从标准曲线上，可以查出待检样品中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。,单向琼脂扩散试验,试剂与器材羊抗人IgG血清待检人血清标准参考血清pH7.4 0.01M PBS缓冲液琼脂粉载玻片、打孔器、37恒温箱、湿盒、可调微量加样器等；,单向琼脂扩散试验,实验方法,标准曲线的制备1制作琼脂板所需要的1.5%离子琼脂，首先分装其1/2量的3%盐水琼脂，溶化后置56水浴中平衡温度备用。2稀释抗体，用pH7.4的PBS稀释标准抗人IgG抗体，使最终浓度为抗体效价的一倍，其分装量应与3%盐水琼脂量相等。3制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG抗体于56水浴中预热，再倾注于已溶化并维持56的3%盐水琼脂中混匀，取5ml即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。4打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔4个，孔距10mm。,单向琼脂扩散试验,实验方法,标准曲线的制备5用PBS缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白：浓度分别为800mg/L、400mg/L、200mg/L、100mg/L。6加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。7将加样的琼脂板放湿盒中，置37温箱，24小时后观察结果。8用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。,单向琼脂扩散试验,实验方法,人血清中IgG正常值的测定：1将已制备好的抗体琼脂板置于打孔模板上，每一琼脂板可打孔2个。2取正常人血清，用PBS做1:4稀释。3.用微量加样器分别取稀释后人血清标本10l加入孔中，每份各加两孔。4.作好标记放湿盒中，置37温箱，24小时后观察结果。,单向琼脂扩散试验,结果计算,分别量取各孔样品沉淀环的直径，根据提供的参考标准曲线，计算待检血清中各种免疫球蛋白的含量成人血清中IgG范围 7001660mg/L,单向琼脂扩散试验,实验结果,单向琼脂扩散试验,实验结果,单向琼脂扩散试验,注意事项：制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性；加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致；加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头；实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备；孵育时间应控制在2448小时，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉淀线的扩散。,单向琼脂扩散试验,