定量分析方法与验证.ppt

第四章 药物定量分析与 分析方法验证,第一节 定量分析样品的前处理方法,第二节 定量分析方法特点（自学）,第三节 药品分析方法的验证,第四节 生物样品分析方法的基本要求,第一节 定量分析样品的前处理方法,一、含卤素有机药物的分析,一、概 述,含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐。结构特点：CX,（一）含卤素有机药物,卤素与脂肪链的C原子相连者，卤素与C原子结合不牢固，可直接测定或水解后测定。,氮芥,氟烷,1 卤素与脂肪链碳原子相连,碘番酸,泛影酸,卤素与芳环相连的药物，卤素与碳原子结合牢固，不能直接进行测定，需经处理后才能测定。,2 卤素与芳环碳原子相连,碘苯酯,诺氟沙星,磺溴酞钠,（二）含金属的有机药物,含金属有机药物,2.有机金属药物:金属原子直接和碳原子以共价键相连，结合牢固，溶液中一般不能解离成离子状态，需经有机破坏后分析。,金属原子不直接和碳原子相连，以金属的有机酸及酚的盐或配位化合物的形式存在.如酒石酸锑钾、富马酸亚铁、葡萄糖酸锑钠等。,富马酸亚铁,硫柳汞,卡巴胂,二 不经有机破坏的分析方法,直接测定法,经还原分解后测定法,经水解后测定法,(一)直接测定法,如：葡萄糖酸锑钠的含量测定 碘量法,适用于金属原子不直接与碳原子相连的或CM键结合不牢固的有机金属药物。（包括配位滴定、氧化还原滴定）,如：富马酸亚铁的含量测定 ChP(2005)铈量法,邻二氮菲做指示剂，微过量的硫酸铈将红色亚铁配合物氧化成浅蓝色高价铁。,(二)经水解后测定法,1、碱水解后测定法,适于卤素和碳原子结合不牢固的含卤素有机药物,回流,回流,Volhard法,银量法,根据终点指示方法可分为：1 莫尔法（Mohr法，铬酸钾指示剂法）2 佛尔哈德法（Volhard法，硫酸铁铵指示剂法）3 法扬氏法（Fajans法，吸附指示剂法）,方 法,指示剂,滴定液,被滴定物,终点变化,莫尔法,K2Cr2O7,AgNO3,卤化物,砖红色,原理,佛尔哈德法,硫酸铁铵,NH4SCN(KSCN),Ag+,红色,法扬氏法,吸附指示剂,AgNO3,卤化物,指示剂变色,例：十一烯酸锌的测定,2、酸水解后测定法,十一烯酸锌,稀盐酸,十一烯酸,氧化锌,EDTA-Na,滴定,(三)经还原分解后测定法,适用于碘原子与苯环直接相连的含卤素有机药物。,NaOH,Zn,+3Na2ZnO2+3H2O,+3NaI+2CH3COONa,NaI的测定,CHPUSP,（KIO3滴定法）,AgNO3滴定,冰HAC,曙红钠指示剂,（Fajans法）,泛影酸,三 经有机破坏的分析方法,(一)湿法破坏,主要适用于含氮有机药物、生物制品分析中N、P等测定的前处理,H2SO4-HNO3 H2SO4-HClO4 H2SO4-K2SO4 HNO3-KMnO4,分解剂/消化剂,辅助分解剂,凯氏定氮法,测定含有氨基和酰胺结构的药物结构,原 理,将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被“消化”成CO2和H2O，有机结合的氮转化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。,常量法含氮量 2530mg 半微量法含氮量 1.02.0mg,凯氏定氮法,凯氏烧瓶,K2SO4(提高消解温度)CuSO4(加快消解速度),硫酸,碱液,硼酸(吸收液)甲基红-溴甲酚绿指示剂,硫酸滴定空白校正,1.高温炽灼法,用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。,(二)干法破坏,氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的待测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据待测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。,2 氧瓶燃烧后测定法（Oxygen flask combustion method）,(1)原理,适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析(3)特点：本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析,(2)适用范围：,(4)装置,燃烧瓶：为500、1000或2000ml无 色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶瓶塞：空心，底部熔封铂丝一根铂丝：下端呈螺旋状或网状。,固体样品：无灰滤纸 液体样品：纸袋 软膏类样品：蜡油纸中包裹后再用无灰滤纸包裹,(5)操作方法,样品的准备,取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,燃烧前燃烧瓶的准备 用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。,样品的燃烧 点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，同法另做空白试验。,(6)吸收液,作用：将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。,例 碘苯酯的含量测定 ChP 置换碘量法,2 碘苯酯,O,I2,NaIO+NaI,1/3NaIO3+2/3NaI,5/3NaI,自身氧 化还原,溴醋酸,5/3NaIO3,2NaIO3,2HIO3+10KI+12H+,6 I2+,6 I2+12Na2S2O3,12NaI+6Na2S4O6,Br2（过量)+HCOOH,HBr（过量）+CO2,NaOH,第三节 药品分析方法的验证,目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。用途：1、药品质量标准起草时，分析方法需经验证。2、药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。,验证内容,准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性与范围 耐用性,一、准确度(Accuracy),1、定义：指测得结果与真实值接近的程度。通常采用回收率试验来表示。2、方法：回收试验法（原料药）：空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,制剂可采用空白辅料中加入原料药对照品法。还应作单独辅料的空白测定。,加样回收试验（中药）已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,UV、HPLC 回收率要求在98102%范围容量分析法 回收率要求在99.7100.3%范围中药分析 回收率一般要求在95105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90110%范围内。RSD一般在3%以内。,数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。,（二）精密度(Precision),定义：系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的程度。常用 标准差（SD）或相对标准差（RSD）表示。,在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品，各测三次。或把被测物浓度当作100%，至少测6次计算RSD进行评价。,1.重复性,同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。,2.中间精密度,不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。,3.重现性,指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。,（三）专属性（specificity）,氧氟沙星乳膏的含量测定图谱,乳膏基质,样品,（四）检测限(limit of detection，LOD),1、定义：,系指试样中被测物能被检测出的最低量。无需定量测定。常用%、ppm、ppb表示。它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。,2、方法：信噪比法（仪器分析方法）：HPLC、GC：用已知浓度样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音(或背景信号)强度N，以能达到SN2或SN3时的样品最低药浓为LOD；UV或荧光分析：多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差(即3空或3S空)作为检测限的估计目视法（非仪器分析方法）：通过已知浓度的样品，目视确定能被可靠地检测出的最低量作为检测限。,（五）定量限(limit of quantitation，LOQ),1、定义：,指在具有一定准确度和精密度的前提下，样品中被测物能被定量测定的最低浓度或量。常用%、ppm、ppb表示 杂质和降解产物定量测定时需确定定量限。,定量限与检测限的差别：定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准确度的要求。,2、方法：非仪器分析方法：与检测限的确定方法相同；仪器分析方法：S/N=10时相应的浓度，作为定量限的估计值。,（六）线性与范围(linearity and range),1、定义：线性：在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。线性范围：指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。可用mgL mgL、gml ugml等表示。,2、方法：线性与范围的确定可用作图法(响应值Y浓度X)或计算回归方程(Ya+bX)来研究建立。采用相关系数(r)表示标准曲线的线性度。对照品的LOQ必须包括在线性范围。,（七）耐用性(robustness),定义：指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。变动因素：溶液稳定性、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期、流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等。,已有重现性验证，不需验证中间精密度,如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充,视具体情况予以验证,准确度,精密度,重复性,中间精,密度,专属性,检测限,定量限,线性/,范围,耐用性,鉴别,杂质定量,杂质限度,含量测定,溶出量测定,检验项目和验证内容,各种含量测定方法对效能指标的要求 1.容量分析法：用原料药精制品(含量99.5)或对照品考察方法的精密度，RSD 0.2；回收率一般在99.7100.3之间。2.UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1。制剂的测定，回收率一般应在98102之间。,线性：吸收度A一般在0.30.7，浓度点n5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应大于0.9999(n5)，方程的截距应近于零。3.HPLC法：要求RSD2，回收率98102之间。线性范围：浓度点n应为57，回归处理 浓度c 峰高H或峰面积A或被测物与内标的响应值之比进行回归，建立方程，r应大于0.999，截距应趋于零。,思 考 题,1、在原料药的分析方法验证中，是否所有指标均需进行验证？2、怎样设计回收率试验？,体内药物分析：是一门研究进入人或动物体内，存在于生物样品（如体液、组织、器官和排泄物等）中的药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学。,一 概 述,(一)体内药物分析的概念,第四节 生物样品分析方法的基本要求,（二）体内药物分析的意义,通过体内药物分析结果可求得药物动力学参数，可了解药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄情况。因此，体内药物分析为药物研究、制剂质量管理、临床用药等提供了数据和信息。另外，在用药过量、误服或服毒等中毒事件中，为解毒急救或判断案情，也需要进行体内药物分析；还有对一些兴奋剂、致幻剂、镇静剂等药物滥用现象也需要进行体内药物进行检测。,（三）体内药物分析的特点,1干扰物质多：生物样品中含有大量的内源性物质，如蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等，样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析。2样品量少、不能重复取样：生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样，且样品量少。3被测成分浓度低：对分析方法的灵敏度及专属性要求较高。在测定前需浓缩、富集以适应分析方法要求。4药物浓度监测和药物滥用：要求分析方法简便、快速,二 常用样品的种类、采集和贮存,（一）样品及采集,1、血样：,血浆(plasma)：全血加肝素、枸橼酸盐、草酸盐等抗凝剂后经离心分取，量约为全血的一半。血清(serum)：血液室温放置后，自然凝固析出的清液。全血采取：一般是静脉取血、针刺手指、耳垂取血 动物实验可直接从动脉或心脏采取,2、唾液：,优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。缺点：药物浓度变化大采取：漱口15分钟，收集自然流出或经舌在口内搅动流出的唾液。也可采取物理、化学方法刺激使唾液流出。,3、尿液：,尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。,优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿样。采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。,（二）样品贮存,取样后最好立即进行分析，不能立即分析的，则短期内冷藏(4)，长期冰冻(-20)。全血未经分离，不宜直接冷冻保持。尿液是很好的细菌生长液，若需收集24小时或更长时间的样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏或加防腐剂（1%甲苯、过饱和氯仿）保存。,三 生物样品的前处理,（一）药物在体内的存在形式,游离型：原形药物或代谢物,缀合物：药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等结合,结合物：药物与蛋白质结合,（二）样品前处理的目的,1、提高测定方法灵敏度、准确度和专属性,2、保护测定仪器不受生物样品中类脂和蛋白质等的污染。,（三）生物样品前处理方法,分离、纯化与浓集,化学衍生化,去除蛋白质,缀合物的水解,有机破坏,1、去除蛋白质,加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃),加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐),加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸),加入金属沉淀剂(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH),酶解法(枯草菌溶素),2、缀合物的水解,尿液中药物多数呈缀合物状态。（1）酸水解：适量盐酸（2）酶水解：常用葡糖酸苷酶或硫酸酯酶或两者混合。,3、有机破坏,适于生物样品中金属离子的测定。硝酸-高氯酸消化),目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分方法：,（1）液-液萃取（LLE）：,多数药物是亲脂性的，可用有机溶剂萃取出来，而大多数内源性杂质是强极性的，不被萃取出。,4、分离、纯化与浓集,液-液萃取中需注意的问题：,适当的有机溶剂：常用乙醚、氯仿等。适当的水相pH值：由药物的pKa值确定，一般碱性药物在碱性条件、酸性药物在酸性条件下萃取。,碱性药物最佳pH 高于pKa值1-2个pH单位酸性药物最佳pH 低于pKa值1-2个pH单位中性药物：pH=7 附近,离子型药物：离子对萃取,提取技术：提取次数尽可能少，不要求提取完全，而要求适量而稳定的提取率。,（2）液-固萃取（LSE）：,将生物样品溶液通过填有适宜担体的小柱，使药物保留在担体上，洗去杂质后，用适当的溶剂洗脱下来测定；或杂质保留在担体上，先把药物洗脱下来测定。,担体,亲水性：硅藻土,疏水性：活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶,常用微型柱：Bound Elut、Sep-pak,用有机溶剂(甲醇)冲洗洗净,用水冲洗活化,上样,用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质,有机溶剂洗脱药物收集洗脱液,微型柱液-固萃取步骤,（3）被测组分的浓集,浓集方法：,1、末次提取时，加入溶剂尽可能少2、挥去溶剂：（1）通入气流（氮气）吹干（2）减压法：适于易随气流挥发或遇热不稳定药物,5、化学衍生化,GC中，极性较大、挥发性低的药物或代谢物极性小、稳定性好的衍生物HPLC中，分子结构无紫外吸收具紫外吸收或荧光的衍生物,GC中化学衍生化：,RCOOH、ROH、RSH、RNH2,CH3I、CH3N2等,RCOOCH3、ROCH3、RSCH3、RNHCH3,例：烷基化,极性降低，挥发性增加,烷基化（碘庚烷、叠氮甲烷）酰化（乙酸酐、丙酸酐）硅烷化（三甲基氯硅烷TMCS等）。,HPLC中化学衍生化,常用衍生化试剂有：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。,化学衍生化,柱后衍生化,柱前衍生化,四、定量分析方法的验证,(一)特异性 所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。,(二)标准曲线与线性范围,6.4,12.8,19.225.6 32,3,2.4,1.8,1.2,0.6,0,茶碱(g/ml),Y=9.56610-2X+6.15310-3 r=0.9995,至少6个浓度点建立标准曲线线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推最低浓度点偏差在20%其余浓度点的偏差在 15%。,(三)精密度与准确度(四)定量下限(五)稳定性(六)提取回收率(七)质控样品(八)质量控制(九)测定结果,五 体内药物分析方法建立的一般实验步骤,1、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等2、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值，考虑分离度。3、空白样品加对照品测定：求得样品回收率，检验样品中是否有干扰。4、体内实际样品测定,