基因表达与蛋白质纯.ppt

报告人 曹雪美,基因表达与蛋白质纯化技术探讨,读书报告,2010年9月30日,主 要 内 容,基因表达体系及优劣势大肠杆菌中表达蛋白质及纯化方法可能碰到的问题,什么是基因表达呢？,基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。,基因表达体系,1.原核体系2.真核体系,大肠杆菌(Escherichia coli),E.coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli 菌株以后，通过温度、诱导剂用量以及诱导时间的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE以检测表达蛋白质,大肠杆菌(Escherichia coli),遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌蛋白，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰,枯草杆菌(Bacillus subtilis),分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体,其 他,乳酸菌(Lactic acid bacteria)沙门氏菌(Salmonella typhimurium)苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis),真核表达,真核细胞表达体系,酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞/组织植物细胞/组织,酵母细胞,可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）;毕氏酵母(Pichia pastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）,昆虫细胞,可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可,CHO细胞,可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高,植物组织,植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便,动物乳腺组织,分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长,原核表达与真核表达的区别,1、载体的区别-整合机制 2、表达产物的区别-蛋白修饰的程度,体系选择,研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物,在大肠杆菌中表达外源基因,获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测,原核表达一般程序,（一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。,原核表达操作步骤,（二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。,1、将连接产物转化大肠杆菌DH5，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。,（三）获得含重组表达质粒的表达菌种,1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50g/ml）中37过夜培养。2、按150比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中，37震荡培养至（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml，离心12000g30s收获沉淀，用100l 1%SDS重悬，混匀，7010min。5、离心12000g1min，取上清作为样品，可做SDS-PAGE等分析。,（四）诱 导 表 达,重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分为：（1）细胞外的分泌表达；（2）细胞内可溶性表达；（3）细胞内不溶性表达，即产物以包涵体的形式存在。,重组蛋白的表达形式,SDS-PAGE,（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）,SDS-PAGE,（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）,SDS-PAGE,（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）,SDS-PAGE,（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）,SDS-PAGE,（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）,按蛋白质类型分单纯表达:pJLA系列,用NcoI/NdeI导入AUG的载体融合表达:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc 分泌表达:pel/ompT分泌肽按启动子分lac及衍生的tac,trc,pac,rac等启动子 IPTG诱导lamda phage PL和PR 启动子 热诱导T7 启动子 IPTG诱导T5 启动子 IPTG诱导ara启动子 阿拉伯糖诱导,大肠杆菌表达载体分类,pJLA50X系列;pcDNAII;etcpET系列(T7 promoter,Novagen公司)pQE系列(T5 promoter,Qiagen公司)pMAL系列(周质表达,BioLabs公司)pGEX系列(GST融合表达,Pharmacia公司)pBAD系列(Arabinose诱导型),常用表达载体,pTYB系列(CBD融合,可以自我切割,BioLabs),Protein A GST（glutathione S-transferase）CBD(chitin-binding domain,BioLabs;cellulose-binding domain,Novagen)calmodulin-binding domain,Stratagene)MBP(maltose-binding protein)GFP(green fluorescence protein)Thioredoxin*帮助二硫键形成Dsb(periplasma enzyme DsbA,DsbC)*二硫键的形成与SUMO(small ubiquitin-related modifier)KSI(ketosteroid isomerase)基本上全部沉淀,各种融合蛋白表达载体,帮助可溶化,帮助分泌到周质,可用亲和层析纯化,His-tag(6-8 Histidine)T7-tag(MASMTGGQQMG)HSV-tag(QPELAPEDPED)S-tag(KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK)HA-tag(YPYDVPDYA)Flag-tag(DYKDDDDK)Myc-tag(EQKLISEEDL),各种用于抗体识别的标记,DTT:intein的Cys 溴化氰:MetThrombin:LVPRGS Factor Xa:IEGREnterokinase:DDDDKPreScissionTM protease:LEVLFQGPGenenase I TM PGAAHYTEV protease:ENLYFQ G,融合蛋白的专一性切割,BL21(DE3)/pLysS:自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体M15/SG13009:自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体BL21TrxB(DE3):thioredoxin reductase 突变 Origami:thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变 适合带thioredoxin reductase的融合表达载体,帮助形成更多的二硫键BR21CodonPlusRIL:富含AT的真核生物基因的表达BR21CodonPlusRP:富含GC的真核生物基因的表达,特殊的表达用菌株,NovagenStratageneInvitrogen BioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheGibco/BRL,重要的原核表达质粒提供商,如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构,尽可能进行可溶性表达;如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清,采用包含体表达比较好;如果希望表达的多肽的分子量小于10 kDa,一定要进行融合表达,采用MBD融合采用GST融合采用CBD融合采用thioredoxin融合采用Origami等宿主菌降低菌体培养的速度 温度(15-30),降低转速,让表达产物可溶化,采用CBD融合(pET36/37)采用Dsb融合(pET39/40)采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)采用带MBD融合(pMAL载体,Biolabs)采用带SUMO融合(pET SUMO,Invitrogen),让蛋白质分泌到间质去,纯化方便:先用 EDTA/蔗糖 溶液处理,然后 5 mM MgSO4 洗出,透析法:简单;但费时,费缓冲液,蛋白质浓度不能过高(容易产生沉淀)快速稀释法:最常用的小规模复性方法;但比较费时,费缓冲液,蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀)超滤透析法:比较省缓冲液,处理量大;但费时,要控制好蛋白质浓度凝胶过滤法:快速,可重复性高,不会产生沉淀,操作复杂一点 亲和层析复性法,水相二相法,etc,包含体来源蛋白质的复性,原核表达优化策略如何避免包涵体表达,延长表达时间（过夜），低温培养（2530）诱导条件的优化 某些氨基酸的取代 共表达分子伴侣，硫氧还原蛋白的融合表达或与目标蛋白的共表达 蛋白毒性，稳定性分析，更换宿主菌(利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌)。培养基中可加葡萄糖，通常用2%的浓度。在培养过程中，要保持细菌摇瓶有良好的通气条件，充足的氧流量可以减少包涵体的形成,重组蛋白的纯化方法,1.层析技术 2.电泳技术,Ni-NTA亲和层析,His标签蛋白的纯化流程,表达量不够高；包含体在8M尿素中不能溶解；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上；Ni-chelating分离纯化的效果不好；GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高,经常碰到的问题,尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体,是不是忘了加还原剂（DTT或巯基乙醇）？是不是在20冻存过？用4M盐酸胍试试,是不是酸性蛋白质？是不是蛋白质的合成提前中止了？（富含Arg,Ile,Leu,Pro这几种氨基酸）可以尝试用BL21 CodonPlus RIL 或 RP 作宿主菌(Stratagen)；使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21,Novagen）以便纯化全长的融合蛋白,His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5 mM EDTA来去除重金属离子的干扰；His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）;其他不明原因导致弱结合,样品没有很好细心去除不溶性物质重复使用前树脂没有洗干净蛋白质之间存在相互作用可以提高盐浓度,改变pH,添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质,是不是在进行复性时用了Redox buffer,尝试用 Urea gradient/Gel filtration来解决,尽快用0.1 N HCl冲洗,用0.1 N NaOH/0.1%SDS洗,主要是溶氧量的问题,可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积,目前我实验过程中碰到的问题,未检测到蛋白表达质粒是否成功转化到宿主菌，是否质粒丢失/不稳定？诱导条件需要优化 稀有密码子问题载体/表达菌不合适 mRNA二级结构是否不利于表达 蛋白性质所致（如疏水性很强，或糖基化位点多，或蛋白毒性较大）缺少SD序列或者不合理，或者被其它二级结构掩埋 检查构建载体的启动子下游的SD序列，是否在插入表达基因时被切掉了或形成二级结构。,THANK YOU!,