基因定点突变技术.ppt

基因定点突变技术,定点突变,定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。,定点突变的目的,基因定点的突变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重排等变异。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具。蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定点改变，缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构和功能，改造酶的不同活性或者动力学特性。,寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。PCR介导的基因突变,定点突破的方法,寡核苷酸介导的定点突变,寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家(michael smith)发明的.,寡核苷酸定点突变基本原理,合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因完全互补。合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型子代链。将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中基因已被定向修改,盒式突变,1985年Wells提出的一种基因修饰技术盒式突变。盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。,PCR介导的定点突变,在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物带有错配碱基便可使PCR产物的末端引入突变。但是诱变部分并不总在DNA的中间部分进行诱变。目前采用重组PCR进行定位诱变，可以在DNA片段的任意部位产生定位突变。,重叠延伸的介导的突变,大引物诱导法,定位突变用途,定点突变法的应用不仅广泛用于基因工程技术领域，还可用于农业培育抗虫、抗病的良种，用于医学矫正遗传病、治疗癌症等病。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。,应用前景,不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人熟悉应用。,在分子生物学和基因工程中的应用,探明未知序列的结构和功能的关系，如启动子诱变筛选，真 核的TATA盒保守序列确定。载体构建：调控元件，强启动子，多接头。研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。,在蛋白质工程中的应用,降低毒性，如TNF改变亚型和种的特异性，如IFN的23位AAG（赖氨酸），AGG（精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝，使IFN种属特异性明显改变，对人抗病毒活性小于牛。提高活性和稳定性，如IFN-ser17（cys变ser）提高蛋白质作用的专一性，如IFN的9-56位被IFNa的7-54位取代后，活性提高40倍。,