基因功能研究方法.ppt

1,基因功能研究方法,2,随着生物学研究在分子水平上的不断深入和推进，越来越多的新基因得以成功克隆，对新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容。,3,1.微阵列分析,微阵列(microarray)是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包括cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片。,4,原理:将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标签(expressed sequence tag,EST)或特异的寡核苷酸片段)按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微阵列就称为DNA芯片。,5,微阵列法分析过程 首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录合成cDNA。再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交,然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达水平低。,6,芯片的制作,目前常用的基因芯片制作方法：接触点样法、喷黑法、原位合成法。接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。,7,喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。在1cm2面积上可喷射10000个点。,8,原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技术。采用的技术原理是在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长，在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。,9,信号检测与结果分析,激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号软件进行进行图象分析和数据处理,10,11,2.基因转导技术,基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观察该细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功能。这是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法之一。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响。主要方法有物理的、化学的和生物的方法。,12,物理方法1.DNA直接注射法:是目的基因导入的最简单方法,但注入量有限,能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转化率很低,多通过肿瘤局部多点注射给药。2.颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压发射装置,加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从而提高肿瘤细胞的转化率。,13,化学方法1.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一种有价值的体内基因转移方法。,14,15,16,17,2.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂，表达效率低下。利用腺病毒与内吞小泡相融合而将其破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。,18,生物学方法(主要通过构建病毒载体来完成)病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转 染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。1.逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低，且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。,19,2.腺病毒(adenovirus,Adv):为近年肝细胞肝癌基因治疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引起宿主免疫反应而使转染效率下降。,20,21,3.反义技术,反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合成的特异互补的DNA 或RNA 片段(或其修饰产物)来抑制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(Antisense oligonuclerotides,ASON)、反义RNA技术和核酶(Ribozyme)技术。,22,3.1 反义寡核苷酸技术 反义核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长、分化等。根据结合部位的不同分为反义DNA（asDNA）、反义RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribozyme）。,23,3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载体,使其离体或体内表达反义RNA,反义RNA 能与靶mRNA形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶基因的表达。,24,3.3 核酶技术 核酶(Ribozyme)技术是一类具催化活性的特殊RNA 分子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构，单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。,25,最常用的为反义寡脱氧核苷酸（反义寡核苷酸），其优点在于其理论上的高度靶特异性（碱基互补）、设计容易、多样且合成简单及高度的局部性和针对性。,26,反义技术的两种技术路线,将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞表达与目标基因互补的mRNA失活，从而阻断目标基因的表达体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作用,27,反义寡聚核苷酸与mRNA特异性结合，阻断翻译过程,28,4.基因敲除和敲入,4.1 基因敲除(Gene knockout)又称基因打靶(genetargeting),是同源重组技术的形象说法。通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。它是指用外源DNA 与受体细胞基因组中顺序相同或者非常相近的基因发生同源重组,整合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA 导入技术。,29,优点：此技术整合位点确定、精确,转移基因频率较高,既可以用正常基因敲除突变的基因,以进行性状的改良和遗传病的治疗;又可以用突变的基因敲除正常的基因,以研究此基因在发育和调控方面的作用。,30,目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下:(1)克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA 序列,用插入、删除、置换、修饰等手段重建DNA 序列,使之成为靶载体;(2)将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的DNA 序列整合到内源基因组中;,31,(3)将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚,将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中,产生的雄性嵌合鼠子代与正常的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠,进而分析被剔除基因的功能。,32,33,4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段,但对于许多基因来说,简单的失活常导致令人费解的无改变的表型。最常见的解释是某些其它基因取代了靶基因的功能,但要在普通基因敲除小鼠中证明这一点十分困难。基因敲入即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因以确定它们是否具有相同功能。,34,基因敲入的设计,是一个类似于普通基因敲除法的一步同源重组过程。不同之处在于,设计打靶载体时需将靶基因第一个外显子的N-端序列缺失,并将新的替换基因置于靶基因的调控序列之下,使其能精确地按照靶基因的调控模式表达。此方法不仅能用一种基因置换另一种基因,且可以系统地改变基因的结构,分析其蛋白产物各功能区的作用。,35,6.人工染色体的转导,转基因技术是进行蛋白功能分析和基因表达调控的有力手段,但使用小的质粒重组体存在表达水平低、缺乏组织特异性等缺点,若将大的DNA片段克隆入酵母人工染色体(YACs)或细菌染色体，可产生较好的表达水平和组织特异性,并可精确地调节同源重组。,36,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。,37,人工酵母染色体就是把酵母染色体上与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。YAC DNA 转导的方法主要有核注射、脂质体介导和酵母原生质体融合等。采用YAC 转导基因的方式可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。,38,39,酵母人工染色体(适用于克隆大片段DNA，0.22Mb。),40,YAC 要具备的主要功能成份,1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,41,7.基因诱捕技术,基因诱捕是通过物理、化学、生物等方法将一个带有外源基因如抗药基因或报告基因的DNA 载体导入到ES 细胞中.外源基因通过捕获到的内源基因表达调控元件获得表达的同时,使内源的基因功能丧失.利用cDNA 末端快速扩增法(rapidamplification of cDNA ends,RACE)或者质粒拯救法可以获知外源基因整合位点旁侧的序列.通过显微注射或ES 细胞融合技术可以获得特定基因缺失的动物用于功能研究.,42,8.新的晶体解析方法,结合已建立的大规模蛋白原核分泌表达与纯化技术系统,将对大量新基因编码蛋白进行晶体培养，通过计算机分析,以研究蛋白质结构和基因功能的方法。,43,目前已成功制备了耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶、耐热碱性磷酸酯酶的蛋白质晶体,并收集了X-衍射数据.在国内首次获得了硒化耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的晶体,在日本的同步辐射光源上收集了3 个波长的分辨率为2.0 的衍射数据。另外,耐热碱性磷酸酯酶的多对同晶置换法的结构解析也在进行之中.通过计算机分析,对不同来源的木糖异构酶的(G+C)%与蛋白质耐热性之间的关系进行了研究。,44,发现精氨酸和一些疏水氨基酸的含量与编码序列的(G+C)%表现出明显的正相关性,这个发现揭示了蛋白热稳定性与DNA 热稳定性相一致的内在规律,阐明了高(G+C)%的生物适合于高温环境的机制。,45,9 基因编码产物相互作用蛋白的研究,细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一个十分重要的方面。目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的基于亲和分析而建立的免疫共沉淀技术和近年来建立和广泛应用的酵母双杂交系统等。,46,免疫共沉淀技术,免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该方法的优点是：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，所处的环境条件也是接近天然状态的，能够反映体内的相互作用情况，也可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物，但应该注意，有时免疫共沉淀的蛋白质并非是直接相互作用，而是间接的相互作用，其灵敏度也相对较低。,47,酵母双杂交系统,酵母双杂交系统是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。优势：它可以用已经克隆的基因从特定细胞的 cDNA表达文库中“钓取”与其编码产物相互作用的蛋白质及相应基因序列，它检测的相互作用在体内发生，无需额外的纯化步骤。,48,酵母双杂交系统也存在不少局限性，如突出的“假阳性”问题以及所分析的蛋白质必须定位于核内才能激活报告基因（不利于核外蛋白间相互作用的研究）等。另外，融合蛋白的构建也很可能会影响到蛋白质的正确折叠。针对这些问题，近年来研究者对其也进行了诸多改进，如采用多个报告基因以减少假阳性，同时也尝试建立了一些不依赖于转录因子活性的新型双杂交系统，如分离的泛素系统和SOS招募系统等。另外，近年来已初步建立了哺乳动物双杂交系统，以更好地模拟细胞内环境，探明蛋白质相互作用的机理。,49,结语,新基因功能研究并没有一个完全固定不变的模式，这里讲的的内容仅是一些基本方法。目前，要研究一种基因的功能，首先进行生物信息学分析已成为新基因功能研究首选和必用方法，它具有方便快捷和经济等优点，研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息，初步推测基因的可能功能，进而制定出进一步的实验室研究方案，进而选择是适当的方法对基因的功能做进一步的研究。应该指出的是，对一个特定新基因功能进行全面和系统的研究往往需要多个领域研究人员的协作，从多个不同侧面对其进行研究，这样才能适应现代生物学的快速发展，所以培养一些学科的交叉型人才是很有必要的。,50,谢谢！,