《蜂蜜中蜂王浆主蛋白1的测定 液相色谱串联质谱法》 编制说明.docx

农业行业标准蜂蜜中蜂王浆主蛋白1的测定液相色谱串联质谱法（征求意见稿）编制说明中国农业科学院蜜蜂研究所2023年07月蜂蜜中蜂王浆主蛋白1的测定液相色谱串联质谱法编制说明一、工作简况（任务来源、制定背景、起草过程等）1 .任务来源2019年，农业部关于下达2019年农业行业标准制定和修订项目资金的通知（农质标函（2019）77号）下达蜂蜜中多肽的测定液相色谱串联质谱法，承担单位是中国农业科学院蜜蜂研究所等，项目计划号为农质标函（2019）77号201926。由于本方法检测目标物的是蜂王浆主蛋白1,为确保标准的名称更准确，2023年5月预审会上将标准名称修改为蜂蜜中蜂王浆主蛋白1的测定液相色谱串联质谱法。项目首席专家为XXX。2 .制定背景2.1. 我国蜂蜜市场混乱，产品质量参差不齐，蜂蜜掺假乱象频出，严重打击我国蜂蜜消费者的信心。我国是蜜蜂养殖和蜂蜜生产大国，多年来位居全球第一。当前，我国蜂群存量高达900多万群，占全球的1/10；蜂蜜年产量50万吨，占全球总产量1/4。尽管如此，我国仍然需要每年进口6千多吨的蜂蜜来满足高端蜂蜜市场需求。究其缘由，主要是我国蜂蜜市场混乱，产品质量参差不齐，蜂蜜掺假乱象频出，严重打击我国蜂蜜消费者的信心。我国疆域广阔，地理气候丰富多样，蜜蜂养殖业具有一定的特色，显著区别于欧美等发达国家。我国养殖的蜜蜂品种主要有意大利蜂蜜（意蜂）和中华蜜蜂（中蜂），其中意蜂的蜂群约600万群，占总量2/3,主要是在平原地区养殖,采用追花逐蜜的方式生产单一花种蜂蜜，其蜂蜜产量高,是当前我国蜂蜜市场供应的主体；中蜂的蜂群约300万群，占总量的1/3,主要是在山区养殖，采用定点养殖和小范围转场的方式生产百花蜂蜜，蜂蜜产量低，但售价高，是我国蜂蜜市场的重要补充部分。“脱贫攻坚”作为当前我国主要政治任务之一，党和国家投入巨大的精力、财力和物力来确保打赢脱贫攻坚战。广大农业科技工作者和劳动人们在生产实践中发现中蜂养殖能够快速有效实现山区贫困人口的脱贫。经过多年探索实践，全国各地涌现了多种“养蜂扶贫”模式。当前，“养蜂扶贫”已经成为贫困山区人们脱贫致富的重要途径之一，深受贫困地区政府和人们喜爱。我国贫困地区主要是集中在山区，通常情况下，山区蜜源植物丰富，种类繁多，非常适合中蜂的养殖。而中蜂养殖技术简单，劳动强度低，经简单指导后便可快速掌握，尤其适用于老人和残疾人等劳动能力有限的贫困群体。作为我国本土蜜蜂，中蜂所产蜂蜜味道独特、营养丰富，深受人们喜爱。与意大利蜜蜂追花逐蜜，转场放蜂的方式不同是,中蜂主要是以定地放蜂为主，中蜂蜜(中蜂蜜)通常一年仅取一次，产量远远低于意蜂蜜。中蜂蜜的价格往往是意蜂蜜的5-10倍，正是中蜂蜜的高价格保证“养蜂扶贫”模式的成功。由于中蜂蜜产量有限，价格高，难以满足市场的巨大需求,不良企业为了追逐高额利润，市场上涌现了大量掺假中蜂蜜，掺假的方式主要是在中蜂蜜中勾兑大量意蜂蜜，甚至完全采用意蜂蜜冒充中蜂蜜。当前我国尚未制定有关中蜂蜜的标准，相关鉴别方法的缺失进一步导致掺假中蜂蜜的市场泛滥。为维护中蜂蜜行业的健康发展，维护蜂农和消费者的权益，保证“养蜂扶贫”模式有效运行，助力我国“脱贫攻坚”的伟大事业，亟需开展中蜂蜜掺假鉴别方法研究,并基于此初步制定和完善中蜂蜜标准。2.2. 基本理化指标难以用于意蜂蜜和中蜂蜜鉴别，基于蜂蜜中MRJPI的检测已有报道，但尚无统一的国家或行业标准。中蜂蜜由于产量有限，且生产地区局限在中国、东亚、南亚和东南地区，相关研究严重滞后意大利蜂蜜。部分研究从糖含量、水分、PH值、游离氨基酸和挥发性小分子等物质等方面对意蜂蜜和中蜂蜜做了初步探讨，但是距离形成准确、可靠的掺假鉴别方法为之尚远。本研究团队发现中蜂蜜和意蜂蜜中的蜂王浆主蛋白(MRJPS)存在一定的差异，如中蜂MRJPl(c-MRJPl)和意蜂MRJPl(卬九-MRJPl)分别为56KDa和59KDa。由于两个蛋白质的分子量差异不大，实验室常用蛋白质电泳技术难以将两者区分开来。而其它蜂王浆主蛋白MRJP2和MRJP3等也存在相识的问题。尽管两种MRJPl的分子量差异较小，但是其氨基酸序列的组成却存在显著的差异，以MRJPl为例，OC-MRJPl和w-MRJP1的氨基酸序列相似度为91%左右。近年来，基于液相串联质谱定量检测靶向蛋白质的取得了巨大进步，相关方法已经在肉类食品掺假鉴别等领域实现了成功应用。本研究团队通过蛋白质数据库比对发现酶解之后的Qc-MRJPl和助Z-MRJPl分别存在11个和12个特异性肽段。采用蛋白纯化技术对中蜂王台的蜂王浆和意蜂蜜的蜂王浆的蛋白质进行分离纯化，获得高纯度的Qe-MRJPl和Qm-MRJP1。同时采用化学合成方法，获得高纯度。C-MRJPI和MZ-MRJPl的特征性肽段标准品(Imdanvndlilntrffdydfgsder),并基于此开发蜂蜜中意蜂和中蜂MRJPl的定量检测方法。通过检测蜂蜜中HW-MRJPl特征性肽段的有无及含量用于鉴别中蜂蜜中是否混入了意蜂蜜，从而判定中蜂蜜的真实性。本项目的研究结果表明，该方法能够有效的应用于中蜂蜜中是否混入了意蜂蜜的掺假鉴别。该方法经进一步优化和完善后，能够基于此制定我国中蜂蜜的标准，从而为维护中蜂蜜行业健康发展和保障“养蜂扶贫”事业贡献科技力量和技术支撑。当前，我国尚未制定或颁布有关中蜂蜜掺假鉴别检测方法或标准，从而导致中蜂蜜市场鱼龙混杂，监管部门因为参考方法的缺失，无法对中蜂蜜产品进行监管和鉴别真假。因此，制定中蜂蜜掺假鉴别方法和标准是十分必要的，也是非常紧迫的一项重要工作。3 .主要起草过程农业行业标准蜂蜜中多肽的测定液相色谱串联质谱法任务下达后，项目承担单位中国农业科学院蜜蜂研究所成立标准起草小组，具体负责项目标准制定工作。3.1. 起草阶段(1)成立标准起草小组中国农业科学院成立标准起草小组，涉及分析化学、蛋白质组学、和食品质量与安全等4名专业人员。参与标准编制的主要工作人员有：XXXX等。具体分工如下：XXX负责制定工作计划、项目分工和工作总结，并开展标准关键点的验证工作以及标准文本和编制说明的完善修改；李XXX负责文献收集整理、技术标准的实践，验证标准的实用性和可操作性。(2)收集资料标准起草小组查阅相关文献和标准，完成了国内外相关资料的收集、整理、分析。通过文献检索并未发现与本标准直接相关的文献报道，同时也未发现相关的标准。(3)标准方法的确定食品中痕量蛋白质的检测分析主要有两种：一种是基于抗原抗体特异性结合的免疫分析法，另外一种是基于酶解肽段的质谱检测法。考虑到免疫分析需要进行抗体的制备，且开发的方法难以进行标准化；而基于质谱的蛋白质分析具有灵敏度高、定量准确、易标准化等优点，因此，起草小组采用基于质谱的蛋白质检测法。与此同时,起草小组制定了利用LC-MSZMS测定蜂蜜中QC-MRJPl和卬介MRJPl的初步研究方案，制定了标准检测方法试验草案，拟订工作计划和工作进度。2020年1-9月，进行相关试验材料的准备，并着手蜂蜜中蜂王浆主蛋白1测定的色谱、质谱条件的研究，同时对样品的前处理过程、目标物的酶解、提取、净化进行了研究，初步完成了检测方法，分别对采自全国范围内的30余种单花蜜样本和百花蜜样本进行了检测分析，基本明确了意大利蜂蜜和中华蜂蜜所产的蜂蜜中蜂王浆主蛋白1的含量范围。在这些工作中我们不断总结经验，改进前处理方法，对方法添加回收率情况及检测精密度进行试验，2020年10月完成了方法适用性、回收率、精密度、定量限及检出限试验。(4)标准编制说明和征求意见稿的撰写2021年4-8月，在上述基础上，确定了试验条件和通过方法验证后，于2021年4月起草小组完成了标准编制说明和征求意见稿的撰写。3.2. 定向征求意见阶段2021年8月-12月，标准起草小组将蜂蜜中多肽的测定液相色谱串联质谱法的文本和编制说明征求意见稿及意见征求表通过以电子邮件方式向高等院校、科研院所等单位的20位生产、教学、科研、质检和管理方面的专家广泛征求意见，请求意见的单位包括：中国农业大学、安徽农业大学、江西农业大学、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、天津科技大学、中国农业科学院农产品加工研究所、北京农业质量标准与检测技术研究中心、秦皇岛海关技术中心、河南省兽药饲料监察所等(见表1),全部为有意见。2022年1月-4月标准起草小组对收到的专家意见进行整理，其中反馈意见20份，共征得意见130条，其中采纳117条，部分采纳0条，未采纳13条。详见蜂蜜中多肽的测定液相色谱串联质谱法标准征求意见汇总处理表。起草小组根据专家意见进一步修改和完善了征求意见稿，初步形成标准预审稿。表1反馈意见专家名单序号姓名单位单位性质所属省区1曾志将江西农业大学高校江西省2张峰中国检验检疫科学研究科研院所北京市3胥保华山东农业大学高校山东省4朱大洲农业农村部食物与营养研究所科研院所北京市5余林生安徽农业大学高校安徽省6夏曦中国农业大学高校北京市7吴宁鹏河南生兽药饲料监察所质检机构河南省8郝智慧中国农业大学高校北京市9肖志勇北京市农产品质量安全中心质检机构北京市10牛庆生吉林省养蜂科学研究所科研院所吉林省11苏松坤福建农林科技大学高校福建省12杜丽平天津科技大学高校天津市13樊霞中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所科研院所北京市14李存天津农学院高校天津市15徐锦忠南京众谱生物科技有限公司质检机构江苏省16隹TK石秦皇岛海关技术中心科研院所河北省17王蒙北京农业质量标准与检测技术研究中心科研院所北京市18王凤忠中国农业科学院农产品加工研究所科研院所北京市19王成新疆农业科学院科研院所新疆20欧阳喜辉农业农村部农业环境质检中心科研院所北京市3.3标准验证阶段2022年2月12月，在完成标准的全部研究工作后，标准起草小组先后联系了3家有资质的检测技术单位进行标准的验证工作，验证工作得到满意的效果。农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）、农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心（北京）、农业农村部环境质量监督检验测试中心（北京）。附件补充材料中详细展示了3家单位的验证报告。3.4. 预审阶段2023年05月07日，项目主持单位中国农业科学院蜜蜂研究所邀请贾光群、常碧影、李俊玲、罗丽萍、樊霞、玄红专、陈辉等7位专家，对标准进行了认真审查，予以通过，并建设将标准名称修改为蜂蜜中蜂王浆主蛋白1的测定液相色谱串联质谱法。根据会议上专家提出的意见形成了预审会意见汇总处理表（见附件）。2023年05月-06月，根据标准预审会专家提出的意见或建议，完善和补充了标准，形成标准公开征求意见稿，提交全国畜牧业标准化技术委员会秘书处。二、标准的编写原则、主要内容及确定依据1 .标准编制原则该标准的编制注重通用性、适用性、可操作性和经济性，所选用的化学试剂和仪器设备简单、容易获得、价格低廉，实验人员在一般的实验室即可操作。该标准积极参考国际和国外先进标准，有利于促进我国标准与国际接轨，促进对外经济技术合作和对外贸易发展。本标准的制定过程中严格遵守国家有关方针、政策、法规和规章，严格执行强制性国家标准和行业标准。力求做到：技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。2 .主要内容及确定依据2.1. 参考文献本标准在充分查阅和比较分析文献的基础上，结合中国的实际情况，制定本标准，主要内容确定依据参考文献如下：1GBT1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则的要求.GB/T20001.4-2001标准编写规则第4部分：化学分析方法3 GB/T5009.1-2003食品卫生检验方法理化部分总则4 HJ168-2010环境监测分析方法标准制修订技术导则5 GB/T6379.2-2004测量方法与结果的准确度第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法6 GBT27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测7张言政.中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种来源真实性研究D.浙江大学,2019.8 Nesvizhskii,AlexeyI,Vitek,Olga,Aebersold,Ruedi.AnalysisandvalidationofproteomicdatageneratedbytandemmassspectrometryJ.4(10):787-797.9 ErbanT,ShcherbachenkoE,TalackoP,etal.TheUniqueProteinCompositionofHoneyRevealedbyComprehensiveProteomicAnalysis:Allergens,Venom-IikeProteins,AntibacterialProperties,RoyalJellyProteins,SerineProteases,andTheirInhibitorsJ.JournalOfNaturalProducts,2019.10 PiriniA,ConteLS,FranciosoO,etal.CapillarygaschromatographicdeterminationoffreeaminoacidsinhoneyasameansofdiscriminationbetweendifferentbotanicalsourcesJ.JournalofHighResolutionChromatography,1992,15(3):165-170.11 ConteLS,MioriniM,GiomoA,etal.EvaluationofSomeFixedComponentsforUnifloralHoneyCharacterizationJ.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,1998,46(5):1844-1849.12 Se-RaWon,Chun-YingLi,Jang-WonKim,etal.ImmunologicalcharacterizationofhoneymajorproteinanditsapplicationJ.FoodChemistry,2009,113(4):1334-1338.13 KamakuraM.RoyalactinInducesQueenDifferentiationinHoneybeesJ.JournalofAgriculturalBiotechnology,2011,473(7348):478-83.2.2. 主要参考依据标准起草小组对国内外相关资料的收集、整理、分析、研究发现蜂蜜在酿制过程中会分泌大量的蛋白质和酶类与蜂蜜相混合，这些蛋白质的总含量约占0.3%,其中含量最高的蛋白质为MRJPC-MRJPl和卬止MRJPI为同源性蛋白，两者具有相同的功能和作用，由于两者源自不同的种属，因此它们的氨基酸序列存在一定差异。通过蛋白质数据库Uniprot对比发现，oc-MRJPl和卬Ti-MRJPl分别存在11个和12个特异性肽段，适用于区别中蜂和意蜂蜂蜜。图1和图2详细展示了QC-MRJPl和助7-MRJP1的氨基酸序列。但是考虑到肽段的特异性、在质谱上的信号响应大小、肽段的热稳定性、有无易于修饰的氨基酸位点等因素,最终从OC-MRJPl和AW-MRJPl分别筛选出其特征性肽段IMDANVNDLILNTR和Ffdydfgsder,适用于采用液相串联质谱技术表征两种蛋白质的存在与否和含量。10203040506070MtrwlfmvvcLgivcqgttsSilrgeslnkSlsvlhewkfFdydfdsderRqdailsgeyDyrknypsdv8090100110120130140DqwhgkifvtMlryngvpssLnviskkigdGgpllqpypdWseakyddcsGivsatklaiDkcdrlwvld150160170180190200210SglvnntqpmCspklltfdlTtsqllkqveIphdvavnatTgkgrlsslaVqpldcningDtmvyiadek220230240250260270280GeglivyhdsDnsfhrltskTfdydpkftkMtingesfttQsgisgmalsPmtnnlyyspVastslyyvn290300310320330340350TeqfrtsnyeQnavhyegvqNildtqssakVVSKSGVLFFGlvgdsalgcWnehrslerhNirtvaqsde360370380390400410420TlqmivgmkiKealphvpifDryinreyilVlsnrmqkmaNNDYNFNDVN1RimdanvndLilntrcenp430Nndntpfkisihl图1OC-MRJPl的氨基酸序列10203040506070MtrlfmlvclGIVeQGTTGNIlrgeslnksLPILHEWKfEDydfgsderrQdailsgeydYknnypsdid8090100IIO120130140QwhdkifvtmLryngvpsslNviskkvgdgGPLLQPYPDWSfakyddcsgIvsasklaidKcdrlwvlds150160170180190200210GlvnntqpmcSpklltfdltTsqllkqveiPhdvavnattGkgrlsslavQsldcntnsdTmvyiadekg220230240250260270280EglivyhnsdDsfhrltsntFdydpkftkmTIDGESYTAQDGISGM/XLSPNtTNNLYYSPVASTSLYYVNT290300310320330340350EqfrtsdyqqNdihyegvqn!LdtqssakvVsksgvlfKjLvgdsalgcwNehrtlerhn!Rtvaqsdet360370380390400410420Lqmiasmkik430NdrtpfkisiEalphvpifdHLRyinreyilvLsnkmqkmvnNdfnfddvnfRimnanvnelIlntrcenpd图2mz-MRJPl的氨基酸序列标准起草小组采用蛋白纯化技术对中蜂王台的蜂王浆和意蜂蜜的蜂王浆的蛋白质进行分离纯化，获得高纯度的QC-MRJPl及助Z-MRJPL同时采用化学合成方法，获得两种蛋白质的高纯度的特征性肽段标准品(IMDANVNDLILNTR和FFDYDFGSDER),并基于此开发蜂蜜中c-MRJPl及助?-MRJPl的定量检测方法。由于中蜂蜜的掺假方式主要是在中蜂蜜中勾兑意蜂蜜，甚至采用意蜂蜜冒充中蜂蜜，因此，可以通过液相串联质谱检测蜂蜜中卬加MRJPI的是否存在及含量用于鉴别中蜂蜜中是否混入了意蜂蜜。本项目的研究结果表明，该方法能够有效的应用于中蜂蜜的掺假的鉴别，并基于此制定了采用液相串联质谱测定蜂蜜中4c-MRJPl及M-MRJPl的试验方案。2.3. 主要内容及确定依据(1)试样前处理关键环节的优化a.蜂蜜中蛋白质的提取：蛋白质的提取是关键的环节之一，它直接影响分析方法的性能。蜂蜜中的MRJPI属于水溶性的蛋白质，因此，采用PBS溶液很容易将其从蜂蜜中提取出来。至于蛋白提取溶液中常用的变性剂尿素和SDS等，标准工作小组通过对比发现，在提取溶液中是否添加蛋白变性剂对试验结果的影响较小，鉴于变性剂的引入，会导致后续处理步骤需要增加对其稀释或者去除等环节。因此，在蛋白质提取中仅仅采用PBS溶液，并且表现出优异的效果。b.酶切条件的优化：蛋白质的还原与烷基化是常规的操作步骤，通常无需深入的优化，其目的旨在破坏蛋白质中的二硫键，使其更易于胰蛋白酶的酶解。蛋白质酶切中胰蛋白酶的添加浓度和酶解时间是需要优化的环节，它直接关系到方法的灵敏度和稳定性。低剂量的胰蛋白酶会导致目标蛋白酶切不彻底，而高剂量则会出现胰蛋白酶的自我酶切，使酶切效率降低，因此，选择出最佳的胰蛋白酶的添加量是方法开发中的关键环节之%鉴于此，标准工作小组从中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中挑选出各8个代表性样本，用于评估最佳的胰蛋白酶添加剂量。由图3可知，在意蜂蜜和中蜂蜜中随着酶用量的增加，样品中MRJPI的浓度在逐渐增加后趋于平稳，表明酶切完全。实验发现，在胰蛋白酶体积为100L时酶切基本达到最佳效果，过多的酶对于酶切并未有明显效果，并且会产生酶内自我酶切降低酶切效率。综合考虑，最终选择使用100L胰蛋白酶对样品中的蛋白质进行酶切。,泮次3 «M1 WH2 (RM3荆条1 Im刖条3腆击门传体取21)0 06-图3胰蛋白酶用量对酶切效果的影响C.复溶溶液的选择：除盐得到的肽段是由洗脱液从C18除盐柱上洗脱下来的，并且无法定容，因此需要对肽段进行干燥，干燥的肽段需要使用相同的体积复溶液进行定容，由于过高的有机相比例会使肽段在质谱上峰形异常，因此本研究采用一定比例的有机相和水的溶液:乙晴-0.1%甲酸水溶液(40:60、30:70、20:80>10:90,vv)>乙懵-0.1%甲酸水溶液来筛选的定容溶液。结果表明，乙懵-0.1%甲酸水溶液(40:60、30:70,vv)会造成特征肽段在出峰位置前有突起，影响定量结果。乙懵-0.1%甲酸水溶液(20:80,vv)与乙胞-0.1%甲酸水溶液(10:90,vv)相比,后者出峰形态更好，并且在3针平行结果显示出峰时间最稳定。综合考虑，最终选择了乙懵-0.1%甲酸水溶液(10:90,vv)作为复溶溶液，见图4。图4不同复溶溶液下的Ffdydfgsder的定量离子色谱图d.色谱条件的优化：使用制备的两种特征肽段的标准工作液进行待测物质的色谱条件优化。为了将肽段在色谱柱上进行较好的保留，在设置初始流动相时，我们首先选择较低浓度的有机相(5%B)O同时酶解后的样本虽然采用固相萃取小柱进行净化，但是制备的样品通常依然存在微量的盐类，选择5%B的初始流动相，可以将其溶解在流动相中，通过切换阀将初始流出的12min的液体切换到废液中，从而减少样品中盐类等物质对质谱离子源的污染，从而降低分析方法的灵敏度。项目研窕小组比较了两款C18色谱柱(HyPerSilGOLD(100*2.lj.9m)KinetexCl8(50*2.1mm)2.6m色谱柱)不同洗脱条件下的化合物分离情况，详细梯度洗脱程序见表2、3和4o此外，图4展示了Qc-MRJPl和Sn-MRJPI的特征性肽段Imdanvndlilntr和Ffdydfgsder的色谱图。表2KinetexC18色谱柱7min的洗脱梯度Time(min)0.00.81.34.55.46.06.17.0A%90908070559595B%1()1()2030959555表3HypersilGOLD色谱柱7分钟的洗脱梯度Time(min)0.00.81.34.55.46.06.17.0A%90908070559595B%101()2030959555表4KinetexCl8色谱柱10分钟的洗脱梯度Time(min)0.01.01.54.04.56.06.57.08.58.610.0A%95958578756040559595B%551522254060959555长时间的梯度洗脱程序可以对目标肽段进行良好的分离，同时减少共流出物质对目标肽段的影响，降低基质效应，从而提升方法的灵敏度。但是长时间的梯度洗脱程序导致分析方法耗时较长,通量变低,在保证分析方法灵敏度的前提下,尽可能缩短液相梯度洗脱时间。项目研究小组在实验中发现肽段出峰集中在20%-40%(B),对梯度进行调整，放缓有机相20%40%之间的增长速度，并且实验中发现若在开始时有机相比例从5%陡增至20%,会造成肽段出峰延迟，使肽段出峰时间分不开，因此调整至15%-40%(B)缓慢洗脱，达到特征肽段出峰时间尽可能地错开的目的。为了能够同时更好的分离特征肽段，不断地调整流动相的梯度洗脱程序、柱温、进样量和流速。最终结果表明：采用C18色谱柱KinetexC18(50mm×2.1mm,2.6m)对目标分析物进行分离，柱温设定为35,进样体积为5L,流动相A：0.1%的甲酸水，流动相B：0.1%的甲酸乙晴。梯度洗脱程序如下：0-0.8Omin,10%B；0.80-1.30min,10%20%B;1.3-4.50min,70%-30%B；4.50-5.40min,30%95%B；5.40-6.00min,95%B；6.00-6.10min,95%10%B；6.10-7.00min,10%B,流速为0.30mLmin,此时峰型最好，分离度最佳。标准工作液中特征肽段的MRM离子色谱图见图5,以及蜂蜜中QC-MRJPl和t/w-MRJPl特征性肽段Imdanvndlilntr和Ffdydfgsder的定量和定性离子色谱，见图6和图7。1104ESIWMFrk皿6CIM22.0<699.3>IlOX4)MIX10.W0.2.d0KinetexC18-7minXlO4ESIMRVFrM-g0VCIM2&0<801.4-958.5>MIX10.WM8Id014KinetexC18-7minMlO4ESIWVFrMrgoVCiMn0I99.3-1)0X4)WIX10.WWI.BMhld0-HypcrsilGOLD-7minXlO4tsirnFrk3S6CtDC&O(SOI.4->»S8.S>MHiO.WM8_B»oh2.4lHypeisilGOLD-7min«104ESI«01Fra«>380.GlCIM22.016W.3-1110X4)MIX4_»0MJ.dQKinetexCI8-IOminxJO4ESIMRVFrac>380.6CIM2&0(801.4->95S.5)M114.WDH.Ld0KinetcxCIS-IOmin3456789Countsvs.三¾fM(ain)图5不同色谱条件下Ffdydfgsder和IMDANVNDLILNTR的定量离子色谱图图6蜂蜜中卬"-MRJPi特征性肽段Ffdydfgsder定量和定性离子的色谱图imm ” 5 *图7蜂蜜中“c-MRJPl特征性肽段IMDANVNDLILNTR定量和定性离子的色谱图e.质谱条件的优化:首先采用全扫描模式确定两种特征肽段的混合工作液中的特征肽段的母离子M+2Hp+,以此确定前体离子的质荷比。然后采用子离子扫描模式筛选出合适的碎片离子，图8详细展示了OC-MRJPl和Om-MRJPl特征性肽段Imdanvndlilntr和Ffdydfgsder的子离子图，并对图谱中的主要碎片离子进行了详细解析和归属。随后通过筛选出的母离子和3-4个子离子,组成MRM通道，开展碰撞能量和锥孔电压的优化，以期获得最佳的质谱响应。表5详细展示了优化之后的特征性肽段MRM参数。仪器在大量的分析化合物之后，会在质量分析器的表面残留一些污染物，导致质量分析结果会有较大的偏差，为保证质量数的准确性，采用校正液对仪器的质量数每周校正一次。在本研究中所有的质量数误差均在0.1amu以内。100-I W 60y9y8v7y6y5FflaYDFGSDER b2b3267 14877988 399111103 42566y40f201250 49353410 17032 295.14374 llb2 I.y6 丫7710.30902 825乎527y556324097b35032927661637750844 487551242 6788320040060080010001200729%IMfQANVNDtILNTR b3y91057 59863 11716400136015799 I 301.11389958 53027y8图8OC-MRJPl和WX-MRJPI特征性肽段IMDANVNDLILNTR和FFDYDFGSDER的T离子图谱，及主要碎片离子的归属。（注：谱图是由液相串联高分辨质谱采集）表50c-MRJPl和WH-MRJPl特征性肽段IMDANVNDLILNTR和FFDYDFGSDER的MRM参数待测组分定性/定量离子对(n)锥孔(或去簇)电压(V)碰撞能量(eV)699.3>4IO.26022MMRJPl699.3>563.26024699.3>1103.4*6022801.4>217.16033c-MRJPl801.4>503.36024801.4>9585*6028注：*为定量子离子(2)实验验证的分析报告a.线性范围、相关系数、检出限和定量限制备标准曲线进样分析，以蜂王浆主蛋白的浓度为横坐标(x,gkg),特征肽段峰面积为纵坐标y,分别绘制标准工作曲线。结果表明，QC-MRJPl和的-MRJPl在20-500mg/kg范围内呈线性相关，相关系数均大于0.99(见表6)。在空白糖浆样品中分别添加5gkg和20gkg的c-MRJPl和的-MRJPl,通过液相串联质谱测定两者的特征肽段，结果显示，两个肽段色谱峰的信噪比均分别大于3和10。基于液相串联质谱的化合物定量分析方法开发原则，当目标物色谱峰的信噪比大于3和10时，便可将其设置为方法检出限和定量限。因此,我们将基于液相串联质谱开发的。C-MRJPl和。"MRJPl的检出限和定量限分别设定为5gkg和20gkgo表6标准曲线及相关参数蛋白质线性范围(gkg)R2线性方程定量限LOQ(gkg)检出限LOD(gkg)amMRJPl205000.995y=65.9104x+4683.7205cMRJPl20-5000.994y=53.4573x+9752.4205b.方法回收率与精密度为了评估方法的回收率和精密度，采用果葡糖浆作为空白基质，高度纯化的蛋白质"c-MRJPl和卬n-MRJP1(纯度>95%)作为参考物质。在果葡糖浆中添加20>100和500gkg的ac-MRJPl和皿-MRJPl于空白糖浆样品中用于评估方法的回收率、准确性和精密度。每个添加浓度的样品做6个平行，并于不同时间做3个批次。样品按照上述优化的前处理进行制备后，由构建的仪器分析方法进行数据的采集与分析，通过日内和日间的多次分析，加标回收率(准确性)分别为84.3%120.5%、83.2%124.1%；日内的相对标准偏差RSD分别为6.2%12.9%、5.4%10.9%；日间的相对标准偏差RSD分别为8.1%10.5%、6.6%8.0%。具体见表7及8。表7蜂蜜中om-MRJPl的加标回收率和相对标准偏差空白添加分析项目第一天第二天第三天糖浆添加意蜂蜜20gkg添加90.191.1109.8102.1110.988.2108.496.999.6116.1116.7112.787.6120.599.8102.389.8112.4日内平均回收率（%）101.1104.3103.8日内变异系数（）10.712.99.3日间平均回收率（）103.1日间变异系数（）10.5100gkg添力口99.389.984.3104.394.1104.593.296.391.1105.2105.4104.182.2109.992.996.291.2103.8日内平均回收率（%）96.797.896.8日内变异系数（）8.88.38.8日间平均回收率（）97.1日间变异系数（）8.15(X)gkg添力U95.8106.5100.2104.888.196.9107.294.292.191.3105.499.1105.387.387.4112.2101.386.9日内平均回收率（）102.897.193.8日内变异系数（）7.58.76.2日间平均回收率（）97.9日间变异系数（）8.1表8蜂蜜中c-MRJPl的加标问收率和相对标准偏差空白添加分析项目第一天第二天第三天糖浆添加中蜂蜜20gkg添加112.0115.6111.S124.1102.9110.2107.498.9101.6118.1118.7114.789.6102.5102.0104.3101.5102.4日内平均回收率（）109.3106.7107.1日内变异系数（）10.97.85.4日间平均回收率（）107.7日间变异系数（）8.0100gkg添加100.390.985.395.395.1