第五章黄酮类化合物ppt课件.ppt

第五章,黄酮类化合物flavonoids,二、理化性质与显色反应,一、概述,三、提取与分离,四、检识与结构鉴定,第五章 黄酮类化合物,五、结构研究实例,第一节 概 述,1.这类成分是在植物中分布最广的一类物质 苷元 苷1950年 104个 1962年 201个 1974年 902个 722个(其中黄酮苷241 个,黄酮醇苷346个)1980年 黄酮总数已达2721个Up to date9000 different flavonoids are known。2.它们大多是以苷的形式存在于植物体的各个部位，尤其是花、叶部分。大多存在于高等植物及蕨类植物中。,历史定义 1952年以前，黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物。色原酮 2-苯基色原酮（黄酮）,一、定义：黄酮类化合物是泛指两个苯环（A环和B环）通过三碳相互连接而成的一系列化合物。,结 构 特 征,具有高度共轭体系为基本生色团，且母核上有OH或OCH3取代（助色团），大多为黄色，结构中有酮基。因此称为黄酮类化合物。符合C6-C3-C6 基本骨架（桂皮酸途径）。均属酚类衍生物,例：,黄酮醇,查耳酮,2.黄酮生物合成的基本途径,C6-C3-C6 Flavanone,苯丙氨酸,A,B,C,Chalcone,黄酮类化合物中主要类别间的生物关系：据推测：黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。由葡萄糖分别经莽草酸途径和醋酸-丙二酸途径生成对羟基桂皮酸和三分子乙酸，合成查耳酮，再经过查耳酮异构酶的作用形成二氢黄酮。二氢黄酮再在各种酶的作用下衍变为各类黄酮。,查耳酮,二、结构分类及相互间的生物合成关系,（一）主要结构类型 已发现的结构类型有20多种，其中有16种主要结构类型。,分类依据：三碳链氧化程度 B环(苯基)连接位置(2-或3-位)三碳链是否构成环状,C3-位：有OH 黄酮醇(Flavonol)无OH 黄酮(Flavone)C23饱和：二氢黄酮（醇）(Flavanone)C3与B环相连：异黄酮（Isoflavone）C环开环：查耳酮（Chalcone）,C环还原：黄烷类,其它类型：花色素类、橙酮类、高异黄酮、酮类,.黄酮类（flavones）,木犀草素，存在于忍冬藤、菊花、浮萍中，具有抗菌作用。,最简单 1/4,黄酮醇类（flavonols）,槲皮素(quercetin)具有抗炎、止咳祛痰等作用。降低血压、增强毛细血管抵抗力、扩张冠状动脉；芦丁(rutin)是槲皮素的O芸香糖苷。用于治疗毛细管脆弱引起的出血病，并用作高血压的辅助治疗剂。,1/3 最常见,豆科植物槐 中药槐米中含有芦丁和槲皮素。,二氢黄酮类(flavanones),4二氢黄酮醇类(flavanonols),水飞蓟素是二氢黄酮醇与苯丙素衍生物缩合成的黄酮木脂素类成分。具有保肝作用，用于治疗急、慢性肝炎及肝硬化，代谢中毒性肝损伤。,5查尔酮类（chalcones）,查尔酮为苯甲醛缩苯乙酮类化合物，其邻羟基衍生物可视为二氢黄酮的异构体，二者可相互转化。,二氢黄酮的吡酮环芳香性低，在碱的作用下易开环生成6-羟基查耳酮，由无色转为深黄色，后者经酸化又能转化为原来的二氢黄酮。,红花在开花初期，花冠呈淡黄色；开花中期，花冠呈深黄色；开花后期或采收干燥过程中由于酶的作用，氧化成红色。,第一个发现的查耳酮类植物成分,6异黄酮类(isoflavones),主要存在于豆科、鸢尾科等植物中。葛根主要含有下列几种异黄酮类成分。葛根总黄酮具有扩冠、增加冠脉流量及降低心肌耗氧量等作用。大豆素具有类似罂粟碱的解痉作用。大豆苷、葛根素及大豆素均能缓解高血压患者的头痛等症状。,7二氢异黄酮类,8.花色素类(anthocyanidins),使花、叶、果、茎等呈现蓝、紫、红等颜色的色素。以苷的形式存在于细胞液中，经水解可生成苷元花色素及糖。,9黄烷-3-醇(flavan-3-ols)及 黄烷-3,4-二醇(flavan-3,4-diols)类,10橙酮类(Aurones),硫磺菊素(sulphuretin),11双苯吡酮类(酮，苯骈色酮 xanthones),水龙骨科植物石韦中的异芒果素具有止咳祛痰的功效。,12双黄酮类,由二分子黄酮衍生物聚合生成的二聚物，多分布于裸子植物中。银杏中含有多种双黄酮，如银杏素。,银杏素 R1=CH3;R2=H异银杏素 R1=H;R2=CH3白果素 R1=H;R2=H,例,槲皮素,柚皮素,(+)儿茶素,大豆素,多以苷的形式存在：O-苷和C-苷苷中常见糖的种类：单糖：D-葡萄糖，D-半乳糖，D-木糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-葡萄糖醛酸 双糖：槐糖，龙胆二糖，芸香糖（Rha1 6Glc），新橙皮糖（Rha12Glc）等 三糖：龙胆三糖，槐三糖 酰化糖：2-乙酰葡萄糖，咖啡酰基葡萄糖,二、存在形式,糖与化合物结合的位置 O-苷：单糖苷 C3、C7、C3、C4 双糖苷 C3、C7；C3、C4 C7、C4 C-苷：C6或C8位,黄酮类化合物的应用,黄酮类化合物的分布 黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部位，尤其是花、叶部位，主要存在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中。有文献估计约有20的中草药中含有黄酮类化合物。如常用的：黄芩、苦参、大豆、葛根、橙、洋葱等中草药和食品中都含有丰富的黄酮类化合物。,黄芩唇形科，黄芩Scutellaaria baicalensis Georgi 的干燥根。清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎。,葛根豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi 的干燥根。解肌退热，生津，透疹，升阳止泻,黄酮类化合物的应用,黄酮类化合物的生物活性抗氧化、清除自由基抗菌、抗病毒扩冠、降血压保肝解痉,银杏叶总黄酮,银杏黄酮,降胆固醇和甘油三酯,抗凝血作用,山楂总黄酮沙棘总黄酮,降血脂、扩冠,血竭总黄酮,抗静脉血栓形成,黄酮类化合物的应用,黄酮类化合物在食品工业中的应用天然甜味剂 黄酮类化合物作为非糖类甜味剂并非多见，但扩大了甜味剂新资源，目前发现主要为二氢查尔酮含氧苷。芳香科柑橘类的幼果及果皮中，含有二氢黄酮类化合物，其本身无甜味，但在适当条件下转化成二氢查尔酮糖苷，则可显甜味。如新橙皮苷二氢查尔酮，其甜度为蔗糖的950倍，,黄酮类化合物的应用,黄酮类化合物在食品工业中的应用天然抗氧化剂 研究表明，黄酮类化合物均具有不同程度的抗氧化作用，尤其芸香苷、槲皮素、银杏黄酮、大豆异黄酮等具有较强的抗氧化能力，可以代替合成抗氧化剂，用于油脂的抗氧化中。天然风味增强剂 有些黄酮类化合物具有增强食品风味的作用，如柚皮苷虽具有苦味，但用在饮料以及高级糖果中却具有增强风味的作用。如柑橘汁中的橘皮苷是其特征的黄酮化合物，用其可以鉴别外观和风味类似柑橘汁的伪劣产品,黄酮类化合物的应用,黄酮类化合物在食品工业中的应用天然色素 黄酮类化合物多呈黄色，同时又具有很宽的溶解特性，既有水溶性的黄酮类化合物，又有脂溶性的黄酮类化合物，所以完全可以据食品加工的需要而选择合适的黄酮类化合物作为着色剂。目前已获准使用的主要有花青素和查尔酮类。含花青苷的食用色素有：杜鹃花科越橘红色素、锦葵科玫瑰茄红色素、葡萄科葡萄皮色素；以查儿酮苷为主的有来自菊科的红花黄色素、菊花黄色素；梧桐科可可色素主成分则是黄酮醇的聚合物，茶科红茶红色素则是儿茶素等多酚类物质的聚合物，禾本科高粱红色素成分为5，7，4一三羟基黄酮。,三、黄酮类化合物的生物活性,1.对心血管系统的作用 Vp样作用：芦丁、橙皮苷等有Vp样作用，能降低血管脆性及异常通透性，可用作防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂。扩冠作用：芦丁、槲皮素、葛根素、人工合成：立可定。降血脂及胆固醇：木犀草素,芦丁片,芦丁是从中国所独有的国槐的花蕾中提取的植物药，具有降低毛细血管的异常通透性和脆性的作用，是心脑血管保护药，国内用于心脑血管药品制剂的主要成分，国外还大量用于食品添加剂和化妆品。,曲克芦丁片(羟乙基芦丁片),毛细血管保护药。具有防止血管通透性异常升高，抑制红细胞和血小板凝集，改善微循环等作用。可用于闭塞性脑血管病，中心性视网膜炎、动脉硬化、冠心病、梗塞前综合症、血栓性静脉炎等疾病。,2.抗肝脏毒作用 从水飞蓟种子中得到的水飞蓟素具有保肝作用，用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化及多种中毒性肝损伤。（+）-儿茶素(catergen)也可抗肝脏毒作用，治疗脂肪肝及因半乳糖胺或四氯化碳等引起的中毒性肝损伤。,水飞蓟片,本品主要化学成份为水飞蓟宾（Silybin)C25H22O10等黄酮类物质。菊科植物水飞蓟（紫花）Silybummarianum(L)Gacntm的果实，经提取精制所得的淡黄色粉末，或结晶性粉末。功能与主治：本品具有保肝及降血脂作用，用于治疗慢性肝炎，早期肝硬变、代谢中毒性肝损伤及高血脂症。,3.抗炎 芦丁及其衍生物羟乙基芦丁、二氢槲皮素等具抗炎作用。4.抗菌及抗病毒作用 如木樨草素、黄芩苷、黄芩素 5.解痉作用 异甘草素、大豆素：解除平滑肌痉挛；大豆苷、葛根素及葛根总黄酮可缓解高血压患者的头痛等症状；杜鹃素、川陈皮素、槲皮素、山萘酚、芫花素、羟基芫花素：止咳祛痰。,6.雌性激素样作用 大豆素(daidzein)等异黄酮具有雌性激素样作用，可能由于它们的结构与己烯雌酚结构类似。,7.清除人体自由基作用,黄酮类化合物多具有酚羟基，易氧化成醌类而提供氢离子，故有显著的抗氧化特点。另外还有降血脂、血糖，抗动脉粥样硬化及抗癌抗突变等作用。,8.抗肿瘤作用,抗癌新药Flavopiridol的发现与研制 Flavopiridol目前正被用于十几项一期和二期的癌症临床试验。最近，不同的研究者证实其对艾滋病也有异于其他药物的疗效。它的早期发现得益于工业界对自然产物的研究兴趣。在从树皮中提取出纯化合物后，前HOECHST公司又进行了结构与人工合成的研究。由此建立了一系列同型物，包括Flavopiridol的专利。,二、理化性质与显色反应,一、概述,三、提取与分离,四、检识与结构鉴定,第五章 黄酮类化合物,五、结构研究实例,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,一、性状 黄酮类化合物多为结晶，少数为粉末。苷元中，二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇具有手性碳，具旋光性，其余黄酮类无旋光性。苷类结构中含糖的部分结构，故均有旋光性，且多为左旋。呈色原因：其颜色与分子中是否存在交叉共轭体系及助色团(OH,OCH3)的种类，数目及取代的位置有关。,以黄酮为例：,在上述黄酮、黄酮醇分子中，尤其在7-位及4-位引入OH及OCH3等供电基后，化合物的颜色加深，但在其它位置引入OH、OCH3等供电基影响较小。,无色,有色,各类黄酮化合物颜色,(1)黄酮（醇）及其苷显灰黄黄色(2)查耳酮 呈黄橙黄色(3)二氢黄酮（醇）为无色。因C2-C3单键，不能发生上述电子转移，进而形成长共轭的缘故。(4)异黄酮由于B环不与其共轭，所以也无色或显微黄色。(5)花色素及其苷：颜色随pH改变而变化。pH8.5 红 紫 兰,二、溶解性,H2O EtOH，MeOH EtOAc，Et2O,CHCl3苷+苷元+,1.苷，苷元分子中有Ar-OH，溶于稀碱水溶液2.苷元：1)一般难溶或不溶于水，但不同结构类型，彼此之间对水溶解性又有一定差异。,黄酮(醇),查耳酮：平面型分子二氢黄酮(醇)：非平面型分子花色素：离子,水中溶解度增加,2)苷元取代基:OH取代多 亲水性 OCH3取代多 亲脂性,3)苷溶于水，且热水 冷水 一般 双糖苷 单糖苷 3-O-糖苷7-O-糖苷,糖的结合位置对水中的溶解度也有一定的影响，4或7-O苷的溶解度就小于3-O苷，原因是结合在极性强的-OH上，将使分子少了一个较强的极性基团，例；棉黄素；,C5或C3-OH与C=O形成氢键，对溶解度供献不大，结合成苷后，对原-OH对溶解度影响不大，相反，若结合在C7或C4-OH时，影响就很大，形成苷后，该-OH的原有的溶解度较大的贡献消失，所以C7-O-苷的溶解度小于C3-O-苷。,三、酸碱性,酸性：来源分子中的酚羟基；可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺。酸性强弱的比较：取决于羟基的数目和位置：7,4-OH 7-或4-OH 一般OH 5-OH 3-OH,（可用于提取、分离及鉴定工作）,7,5,3,4,3,5NaHCO3 5Na2CO3 0.2%NaOH 4%NaOH,(二)碱性,来源:-吡喃酮上1-位氧原子的未共用电子对，显微弱的碱性，可与强酸生成铁（yang）盐而溶于酸水中。应用:1.黄酮类化合物溶于浓硫酸，可表现特殊的颜色，用于鉴别黄酮结构类型。2.鉴别某些甲氧基黄酮,羊,四、显色反应,黄酮类化合物与各种试剂的呈色，多与结构中Ar-OH及-吡喃酮有关。(一)还原试验:HCl-Mg(Zn)反应;Na(K)BH4反应(二)金属盐类试剂的络合反应:Al3+;Pb4+;Zr4+;Sr2+(三)硼酸显色(四)碱性试剂显色反应,（一）还原试验1、HCl-Mg(Zn)反应,一般 黄酮（醇）为正反应 显橙红紫红色 二氢黄酮（醇）少数显紫兰色 HCl-Mg的呈色反应，（1）同类化合物，当B环上有OH，OCH3取代时，颜色亦随之加深。（2）儿茶素不显色，异黄酮除个别外，一般不显色。,（3）橙酮,查耳酮,花色素对HCl-Mg反应为负反应.但在浓HCl中花色素及部分橙酮、查耳酮会发生颜色变化。所以必要时，应做对照实验。如果将样品乙醇中只加入浓HCl便产生红色，则表明含有花色素及某些橙酮，查耳酮。,2.Na(K)BH4反应,是二氢黄酮的专属试剂反应颜色:红紫色 取样品10mg溶于甲醇，加NaBH4 10mg，再滴加1%浓盐酸或浓硫酸，呈红-紫色。其他黄酮类化合物均不显色二氢黄酮类另一个显色反应：与磷钼酸呈棕褐色,（二）金属盐类试剂的络合反应,黄酮类化合物分子中若含有下列结构单位,常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等试剂生成有色络合物。以上任一结构都可以与一些金属盐生成有色络合物,常用金属盐试剂有:,1.铝盐 常用1%AlCl3或Al(NO3)3乙醇(甲醇)液 例如:黄酮的络合物 为鲜黄色,多数有黄绿色 荧光(1)定性：鉴别是否为黄酮化合物.(2)定量：黄酮化合物与AlCl3反应后有最大吸收峰，用于定量。,2.铅盐 常用1%Pb(OAc)4或Pb(OH)2(OAc)4水溶液:黄酮与铅盐 可生成水不溶性沉淀(黄红色)沉淀颜色与酚OH数目、位置有关Pb(OAc)4只能与分子中具有邻二酚OH的黄酮反应Pb(OH)2(OAc)4与一般酚OH都能反应 此法可用于提取分离、鉴定,3、锆盐：常用2%ZrOCl2甲醇液 应用:区分游离的3-OH或5-OH 现象 区别 3-OH黄酮 黄色络合物 仍呈鲜黄色 ZrOCl2 黄绿色荧光 加枸橼酸溶液 黄色溶液 5-OH黄酮 显著褪色 5-OH和3-OH黄酮-锆络合物的稳定性不同,4、镁盐 常用1%Mg(OAc)2甲醇溶液 应用：区分二氢黄酮(醇)-天蓝色荧光 黄酮(醇),异黄酮-黄橙黄褐色5、氯化锶（SrCl2）沉淀反应 Sr2+在氨性甲醇溶液中与分子中具有邻二酚OH黄酮类化合物生成绿色棕色或黑色沉淀 应用：鉴别邻二酚OH6、三氯化铁反应 为酚OH颜色反应,无专属性 当含有氢键缔合的酚羟基时，颜色更明显。,（三）硼酸显色反应,含 结构的黄酮为正反应 5-OH黄酮（醇）包括 2-OH查耳酮在 与硼酸生成不同颜色,草酸中显黄色并具 黄绿色荧光柠檬酸（丙酮）中只显黄色无荧光,应用：该反应可将上述两类黄酮与其它类别黄酮相区别,例：,（四）碱性试剂显色反应,在日光及紫外光下，通过纸斑反应，观察样品用氨蒸气和其他碱性试剂处理后的颜色变深的情况。应用：1.黄酮类的鉴别2.鉴定二氢黄酮与查耳酮：二氢黄酮 查耳酮 无色 橙黄色3.黄酮醇：显黄色。通空气变棕色可与其它类型黄酮相区别4.邻二酚羟基或3，4二羟基：在碱液中不稳定，易氧化，颜色变深，黄红绿棕色沉淀,（五）Gibbs反应,检查5-OH对位未被取代的黄酮。将样品溶于吡啶中，加入Gibbs试剂显蓝或蓝绿色。Gibbs试剂:甲液：0.5%2,6-二氯苯醌-氯亚胺的乙醇溶液。乙液：硼酸-氯化钾-氢氧化钾缓冲液(pH9.4),补充,（五）Wessely-Moser重排,黄酮类6-及8-C-糖苷在常规酸水解条件下可发生互变生成6-和8-C-糖苷的混合物。,HCl-Mg反应HCl-Zn反应NaBH4反应锆-枸橼酸反应SrCl2反应硼酸+草酸反应Molish反应,（+）黄色，+枸橼酸,褪色,练习：下面的一个化合物可能发生的反应,芦丁（rutin）,（+）,（+）,（+）,（+）,（+）,（-）,（+）黄色,配伍题A.ZrOCl2拘橼酸反应 B.无色亚甲蓝反应 C.Molish反应D.SrCl2/NH3.H2O E.NaBH4反应1.用于鉴定区别3或5羟基的反应2.用于鉴定黄酮和黄酮苷的反应3区分萘醌与香豆素的反应 4二氢黄酮的专属性反应5邻二酚羟基的反应,ACBED,用化学方法区别下列各组化合物：,D,D,二、理化性质与显色反应,一、概述,三、提取与分离,四、检识与结构鉴定,第五章 黄酮类化合物,五、结构研究实例,第三节 黄酮类化合物的提取与分离,一、提取（一）提取 从植物中提取黄酮类化合物选择溶剂时需考虑：1.黄酮类化合物在植物中存在的形式：2.材料植物的哪一部分 花、果、叶多含苷 坚硬的木质部苷元,3.杂质的情况(1)原料中伴存亲脂性杂质，如叶绿素、油脂、甾体等。可先用石油醚处理除去(2)原料中伴存的水溶性杂质，可用EtOAc或n-BuOH为溶剂，或用铅盐沉淀法提出黄酮类化合物。,1、苷类及极性大的苷元提取，一般常选用丙酮，乙醇，甲醇，乙酸乙酯，水。最常用的是醇或醇水。,方法：可用温浸，回流，水煎煮。对于多糖苷，则可用沸水提取，为防止酶水解，一般应先破坏酶。花色素在植物中一般是以盐的形式存在，提取时，先加少量的酸，如1%（HCl），使花色素游离出来，再用水提取。对于含脂肪较多的原料，也可先用石油醚脱脂，除去杂质。甲醇，乙醇穿透力强，提取效果好，但甲醇有毒，所以习惯上，常用乙醇提取，如下列流程。乙醇提取物 石油醚除杂质 乙醚提取苷元 乙酸乙酯提取苷。,对得到的粗提物可进行下列精制处理，常用方法有：,溶剂萃取法碱提取酸沉淀法炭粉吸附法,1.溶剂萃取法,材料 醇浸膏 不溶物 水液 亲脂性杂质,MeOH(EtOH)热提,热水反复溶解,Et2O萃取,(1)系统溶剂提取,Et2O萃取液 水液(黄酮苷元,部分单糖苷)EtOAc液(单糖苷,双糖苷),(如叶绿素,树脂物),EtOAc萃取,n-BuOH萃取,n-BuOH液(双糖苷,三糖苷),水液(水溶性杂质),水液,(2)除去亲脂性杂质,(3)除去水溶性杂质,醇,2.碱提取酸沉淀法,此法适用于含量高的已知黄酮成分如：槐米 rutin(芦丁)1020%黄芩 baicalin(黄芩苷)45%枳实 hesperdin(橙皮苷)45%注意：1）碱的浓度不宜过高，以免破坏黄酮母核，酸的浓度也不宜过强，以免生成佯盐溶解。2）药材中含大量水溶性杂质时，宜用石灰乳或石灰水提取，使含羧基盐成钙盐沉淀。,3.炭粉吸附法,药材甲醇提取物,分次加入活性炭，搅拌，静置，检查上清液有无黄酮反应，过滤,滤液,吸附后活性炭粉,依次用沸水、沸甲醇、7%酚/水、15%酚/醇 分段洗脱,沸水,沸甲醇,7%酚/水,15%酚/醇,浓缩，加乙醚,乙醚层（酚）,水层（黄酮苷）,二、分离,分离的主要依据：1、极性大小不同；选用吸附层析或分配层析，极性大的用分配层析，极性小的用吸附层析。如极性大的用氧化铝，吸附太强，不易洗脱。2、根据酸性不同，可采用PH梯度法。3、分子大小不同，用葡聚糖凝胶进行分离。4、分子中功能基团不同，利用与金属盐络合能力不同的特点进行分离。,二、分离,（一）采用各种色谱方法：硅胶色谱：按极性大小分离，主要分离极性 小和中等极性的化合物。可用PTLC。聚酰胺色谱：原理：氢键吸附 葡聚糖凝胶色谱：原理：分子筛结合吸附,硅胶柱色谱,适于分离异黄酮，二氢黄酮（醇）及高度甲基化的黄酮及黄酮醇类等极性较小的黄酮类。少数情况下，硅胶加水去活化后，也可用来分离某些极性较大的黄酮，如多羟基黄酮醇及其苷类等,聚酰胺柱层析,聚酰胺对分离黄酮类化合物，是一种较为理想的吸附剂。与纤维素粉相比，其具有吸附容量大，分辨能力强的特点。吸附原理：氢键吸附,其吸附主要是通过聚酰胺中的C=O与黄酮分子中的酚-OH及氨基与黄酮中的C=O形成氢键而吸附的.,（1）黄酮类与聚酰胺形成氢键的能力大不同，如分子中的酚-OH的数目，位置等。,（2）洗脱剂与聚酰胺或洗脱剂与黄酮类形成氢键的能力越强，洗脱力越大。如水和甲醇，二者中甲醇与聚酰胺形成氢键的能力比水强，洗脱力就大于水。,水 含水醇醇 丙酮NaOH/H2O甲酰胺二甲基甲酰胺尿素/H2O,其吸附强弱取决于,其洗脱顺序先后(1)苷元相同,三糖苷双糖苷单糖苷苷元(2)母核上羟基增加，洗脱速度减慢 无酚-OH 一个酚-OH 二个酚-OH 三个酚-OH.(3)羟基数目相同,有缔合羟基无缔合羟基(4)不同类型黄酮的洗脱顺序：异黄酮二氢黄酮（醇）查耳酮黄酮黄酮醇（芳香核、共轭双键多者吸附力强，如查耳酮难洗脱）,习题：下列黄酮化合物，（1）用聚酰胺柱色谱，含水甲醇梯度洗脱，（2）用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，分别写出洗脱顺序,答案：,聚酰胺柱色谱洗脱顺序：由先到后 D，E，C，B，A 2.用硅胶柱色谱洗脱顺序：由先到后 A，B，C，D，E,3.葡聚糖凝胶(Sephadex)柱色谱,常用型号：Sephadex-G型 Sephadex-LH20型原理：分离游离黄酮靠吸附作用。吸附程度取决于游离酚羟基数目，苷元的羟基数越多,越难洗脱。分离黄酮苷分子筛起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类按分子量由大到小的顺序流出柱体。洗脱剂：甲醇、乙醇、碱水、含水丙酮等,应用：分离酸性强弱不同的黄酮苷元 酸性比较：7,4-OH 7-或4-OH 一般OH 5-OH,溶于 NaHCO3 Na2CO3 不同浓度的NaOH,样品,乙醚,乙醚液,依次萃取,5%NaHCO35%Na2CO30.2%NaOH4%NaOH,分别酸化,各部分黄酮,（二）梯度pH萃取法,（三）根据分子中某些特定官能团分离 主要为邻二酚OH,1、铅盐沉淀法：粗分离 沉淀（含邻二酚OH）黄酮混合物+Pb(OAc)4 脱铅方法：硫酸盐法、磷酸盐法或阳离子交换树脂法,溶液,（三）根据分子中某些特定官能团分离 主要为邻二酚OH,2、硼酸复盐法：络合作用原理：具有邻二酚OH的黄酮可与硼酸络合，生成的物质可溶于水；无邻二酚OH的黄酮无此反应，不溶于水,在实际分离工作中，常常将上述多种方法相配合，以获得较好的分离效果实例：从柠檬果皮中分离降血压有效成分,习题：从某植物中分离出四种化合物，其结构如下：,(1)试比较四种化合物的酸性(2)比较极性大小(3)比较它们的Rf值大小顺序：硅胶TLC 聚酰胺TLC,A R1=R2=H B R1=H,R2=Rha C R1=Glc,R2=HD R1=Glc,R2=Rha,Rf：ABCD DBCA,酸性 ACBD,极性 DCBA,二、理化性质与显色反应,一、概述,三、提取与分离,四、检识与结构鉴定,第五章 黄酮类化合物,五、结构研究实例,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,一、色谱法在黄酮类化合物鉴定中的应用 1.纸色谱(PC）(1)常用溶剂系统醇性：BAW(n-BuOH-HOAc-H2O)4:1:5 TBA(t-BuOH-HOAc-H2O)3:1:1 水饱和的n-BuOH等水性:H2O、不同浓度的醋酸(2%醋酸、15%醋酸等)、3%NaCl、HOAc-浓HCl-H2O(30:3:3),双向纸色谱法,(2)不同极性溶剂中Rf值的比较 a.在醇性展开剂中 不同苷元时 平面性分子Rf值非平面型分子 同类型苷元时 苷元Rf值单糖苷双糖苷,b.在水性展开剂中(极性大的化合物Rf值大）不同苷元时 平面分子Rf值rutin 15%HOAc:Rf值 quercetinrutin,混合物的鉴定：常用双向色谱如黄酮苷的分离通常第一向采用醇性溶剂 第二向采用水性溶剂,(3)显色剂 UV下观察 1%2%AlCl3(MeOH)1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6 1:1水液,2.薄层色谱（TLC）,(1)硅胶薄层色谱分离与鉴定弱极性黄酮 常用展开剂：甲苯-甲酸甲脂-甲酸 54 1 CHCl3-MeOH-HCOOH 821 CHCl3-丁酮-甲酸 531,(2)聚酰胺薄层特别适合含游离酚羟基黄酮及苷 常用展开剂：a.含水极性溶剂：不同浓度的含水乙醇（形成H键）b.亲脂性有机溶剂：分配色谱原理 乙醇-水-乙酰丙酮(2:4:1)苯-甲醇-丁酮(6:2:2)(3)显色剂 同PC显色剂,二、紫外及可见光谱在黄酮类鉴定中的 应用,测定黄酮类化合物的UV吸收光谱，对结构的鉴定有特殊意义 特点：用量少用特殊试剂使黄酮母核上官能团发生反应，提供有关取代基的位置或数量的信息,二、紫外及可见光谱在黄酮类鉴定中的应用,一般程序如下：1、测定试样在甲醇溶液中的UV光谱原始谱;2、测定试样在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱。常用的诊断试剂有:甲醇钠、醋酸钠、醋酸钠/硼酸、三氯化铝、三氯化铝/盐酸3、如为苷类，先水解或甲基化再水解，测苷元或衍生物的UV。,黄酮存在桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭系统，在200400nm间，有两个主要的紫外吸收带,A环苯甲酰系统峰带II，220280nm,B环桂皮酰基系统峰带I，300400nm,共性：B环OH增加，峰带I 红移，特别是4-OH，红移大；A环OH增加，峰带II 红移。,第四节 结构鉴定,（一）,1.黄酮及黄酮醇类 带 带 黄酮 220280nm 304350nm I350nm 3-OR 328385,nm,I,II,峰带I和强度相似,1.表5-8:说明B环氧取代程度,则带红移.2.表5-9:说明A环氧取代程度,则带红移.3.若OH甲基化或苷化,引起相应吸收带,尤其带紫移.4.若OH乙酰化,原来酚OH对光谱的影响 消失.,2.查耳酮及橙酮类 共同特点:带很强为主峰,带为弱峰.带 带 查耳酮 220270(弱)340390(强)橙 酮 220276(较强)370430(强)2位引入OH时谱带红移较大;2-OH甲基化或苷化时可引起带紫移1520nm,nm,I,II,带I 强，带II 次强峰,3.异黄酮,二氢黄酮及二氢黄酮醇 共同特点:带强吸收为主峰,带为弱峰.带 带异黄酮 245270(强)300-340（弱）二氢黄酮(醇)270290(强),nm,I,II,带I 弱，带II 强峰,(二)加入诊断后引起的位移及其在结构测定中的意义,以黄酮醇为例一般程序:1.测定样品在MeOH中UV吸收光谱-原始谱 2.加入诊断试剂后测定UV及可见光谱,(二)加入诊断试剂后引起的位移及其在结构测定中的意义(1)MeONa:碱性强 a.检查黄酮(醇)中游离3-OH或4-OH 4-OH存在 带+4060nm,峰强度不下降 3-OH存在，带+5060nm,峰强度下降,b.检查黄酮(醇)中游离 3,4-OH体系或 3,3,4-三OH等对碱敏感的OH产生吸收峰,其强度随时间延长而递减.,确定 4-OH,（2）NaOAc（未熔融）NaOAc比NaOMe的碱性弱,只能使强酸性OH离子化,检查7-OH,3-OH,4-OH a.7-OH存在,带+520nm b.4-OH存在,无3-OH或7-OH取代时,在MeOH,NaOAc光谱中带位移的比较,在长波一侧有明显肩峰。,确定 7-OH,（3）NaOAc（熔融）醋酸钠(熔融)碱性提高,表现与NaOMe 类似效果.带红移4065nm，强度下降，示有4-OH（4）NaOAc/H3BO3 NaOAc与H3BO3的混合物用于检识黄酮母核上的所有邻二酚OH a.B环有邻二酚OH存在,则带+1230nm b.A环有邻二酚OH存在,则带+510nm,（5）AlCl3及AlCl3/HCl(1)AlCl3与含3-OH或5-OH的黄酮(醇)以 及邻二酚OH螯合,使吸收峰红移(2)由于AlCl3形成络合物的稳定性为:3-OH5-OH二氢黄酮5-OH邻二酚OH二氢黄酮醇3-OH 酸水存在下 不稳定,AlCl3/HCl谱图=AlCl3谱图 则结构中无邻二酚OHAlCl3/HCl谱图 AlCl3谱图 则结构中可能有邻二酚OH a.若B环有邻二酚OH存在 则带-3040nm,b.若A.B环均可能有邻二酚OH,则带-5065nm,AlCl3/HCl谱图=MeOH谱图 示无3-及/或5-OHAlCl3/HCl谱图 MeOH谱图 若只有5-OH存在,带+3555nm 只有3-OH存在,带+60nm 可能同时有3及5-OH,带+5060nm 若除5-OH外,尚有6-O取代,则带+1720nm,二、理化性质与显色反应,一、概述,三、提取与分离,四、检识与结构鉴定,第五章 黄酮类化合物,五、结构研究实例,示例从某中药分得一淡黄色细针状结晶A，对FeCl3反应阳性，Molish反应呈紫红色环，HCl/Mg反应紫红色,二氯氧锆-枸橼酸反应黄色褪去,SrCl2反应阴性，其紫外光谱数据如下：MeOH：266 349 NaOMe：274 322 392（强度不降）NaOAc：273 375 AlCl3：274 304 347 395 AlCl3/HCl：274 304 347 395A结晶经水解后，水解物B对二氯氧锆枸橼酸反应黄色不褪，母液中检出葡萄糖，推测A、B的结构式。,解答：1.FeCl3：阳性，示有酚OH2.Molish：呈紫红色环，示有糖3.HCl/Mg：紫红色,示为黄酮4.二氯氧锆-枸橼酸：黄色褪去,示有5-OH5.SrCl2：阴性，示无邻二酚OH6.MeOH：示为典型黄酮7.NaOMe：带I红移392-349=43nm,强度不降，示有4-OH,8.NaOAc：带II红移273-266=7nm，示有7-OH9.AlCl3/HCl：带I红移395-349=46nm，示有5-OH,无3-OH10.AlCl3/HCl=AlCl3：示无邻二酚OH11.水解产物B黄色不褪，葡萄糖应连在3位,三、氢核磁共振在黄酮类结构分析中的应用 1、测试溶剂:氘代氯仿、氘代二甲亚砜(DMSO-d6)、氘代吡啶等 2、制备成衍生物 黄酮类化合物1H-NMR谱(DMSO-d6)特征,5OH：12 ppm7OH：11 ppm3OH：10 ppm,加入重水（D2O）信号消失,黄酮类1HNMR的一些规律:(一)A环质子：5,7-二羟基黄酮类化合物:,A环上的芳氢：6H：5.7-6.9(d,J=2.5)8H：5.7-6.9(d,J=2.5)且6-H位于较高磁场区,6,8,间位偶合,(一)A环质子：7-羟基黄酮类化合物,A环上的芳氢：5-H：7.98.2（d,J=9.0）6-H：6.77.1（dd,J=9.0,2.5）8-H：6.77.0（d,J=2.5）,黄酮醇,H-5:C=O负屏蔽 dH 8.0,(一)A环质子：7-羟基黄酮类化合物 二氢黄酮醇,A环上的芳氢：5-H：7.77.9（d,J=9.0）6-H：6.46.5（dd,J=9.0,2.5）8-H：6.36.4（d,J=2.5）,(二)B环质子：4-氧取代黄酮类化合物:,B环上的芳氢（H-3,5 较为高场）：H-3,5：6.57.1（d,J8.5）H-2,6：6.57.9（d,J8.5）,为AABB系统,(二)B环质子：3,4-二氧取代黄酮及黄酮醇,B环上的芳氢：H-5：6.77.1（d,J8.5）H-2：7.27.9（d,J2.5）H-6：7.27.9（dd,J8.5,2.5）,(二)B环质子：3,4-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇:H-2,5,6复杂的多重峰出现6.707.10(二)B环质子：3,4,5-三氧取代黄酮类:H-2和H-6作为单峰出现在6.507.50;如3或5-OH甲基化或苷化时,则为二重峰(d,J=2.0 Hz),H-2（异黄酮）:7.67.8(1H,s);8.58.7(1H,s,DMSO-d6),（三）C环上的氢：,H-3（黄酮）:6.3(1H,s),（三）C环上的氢（二氢黄酮和二氢黄酮醇）：,化合物 H-2 H-3二氢黄酮醇 4.80-5.00 d(11.0)4.10-4.30 d(11.0)二氢黄酮醇3-O-糖苷 5.00-5.60 d(11.0)4.30-4.60 d(11.0),ABX系统,（三）C环上的氢（查耳酮）：,H-：6.50-6.70(1H,d,J=Ca.17.0)H-：7.30-7.70(1H,d,J=Ca.17.0),（三）C环上的氢（橙酮）：,苄氢:6.50-6.70(1H,s)6.37-6.94(1H,s,DMSO-d6),(四)糖上的质子,1.单糖苷 糖上端基质子 一般游离糖的H-1 dH 4.0 成苷后 糖的H-1 dH 5.0原因:1)由苷键O原子上电子与苷元P-共轭 2)糖上C1与O()相连吸电子,使C1缺 电子,致使H-1上电子云密度降低多,H-1共 振峰在较低磁场区出现.,A.苷元上糖位置不同,糖端基质子的化学位移不同 例.黄酮类 3-O-糖苷 4,5,7-O-糖苷 dH低场一些 5.06.0ppm 4.85.2ppm B.与糖的种类有关 例.黄酮醇 3-O-glc苷 黄酮醇-3-O-rha苷 H-1 dH 5.7-6.0ppm 5.05.1ppm,化合物 糖上的H-1黄酮醇3-O-葡萄糖苷 5.70-6.00黄酮醇7-O-葡萄糖苷 4.80-5.20黄酮醇4-O-葡萄糖苷 黄酮醇5-O-葡萄糖苷 黄酮醇6及8-C-糖苷 黄酮醇3-O-鼠李糖苷 5.00-5.10二氢黄酮醇3-O-葡萄糖苷 4.10-4.30二氢黄酮醇3-O-鼠李糖苷 4.00-4.20,糖上的氢,2.双糖苷 苷元-O-糖-O-糖 直接与苷元相连 末端糖的端基质子的端基质子共振峰在稍 化学位移稍小(共 低磁场(化学位移稍大)振峰在较高磁场),(五)6-及8-CH3,dH 2.0，且6-CH3质子较8-CH3质子稍高场0.2ppm,(六)甲氧基上的质子,苷元上OCH3:dH 3.504.10ppm,(七)乙酰氧基的质子,化学位移 应用芳香族 2.302.50ppm 乙酰化测定 酚OH数目脂肪族 1.652.10ppm 由脂肪族乙 酰氧基数目 推测苷中结 合糖的数目,四.13C NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用,黄酮类化合物结构鉴定 60年代 UV 70年代 UV 1H NMR 80年代 主要为13C NMR 13C NMR信号归属:(1)用简单化合物及其衍生物进行比较(2)用经验性取代基位移规律计算,(一)黄酮类化合物骨架类型的判断,利用中央三碳核的信号特征,推测黄酮化合物的骨架类型,(二)黄酮类化合物取代图式的确定方法,采用芳香碳原子的信号特征确定取代基的取代图式.,(三)黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置,苷元上成苷的酚OH位置不同 苷化位移值不同糖种类不同,1.糖的苷化位移及端基碳的信号 糖上 C1 95105左右 成苷后糖上 C1 则+4.06.0ppm C1 C1例:b-D-glc 96.6 a-L-rha 95黄酮3-O-b-D-glc苷 101+4.4 3-O-rha 101.9+6.9 7-O-b-D-glc苷 100.4+3.8 7-O-rha 98.9+3.9,取代基位移,第四节 结构鉴定,2.核磁共振碳谱（13C NMR）,5,7-二羟基黄酮中的C-6、C-8信号,在这一类化合物中，C-6、C-8信号一般在90-100ppm之间，其它信号均处于低场，因此，这两个信号最好分辨。这两个信号的区别是；C-6总是比C-8处于高场。另外，该两个碳处于间位，相互间的取代基影响不大，即无论C-6上的-OH、CH3，glc取代，只引起C-6信号位移，而对C-8影响不大。同样，C-8上的取代基对C-6影响也不大。,第四节 结构鉴定,例：下列一个化合物的碳信号归属,糖的苷化位移,糖成苷后，其端基13C信号将发生变化：连接在酚-OH上，端基13C信号将向低场位移4-6ppm。一般酚苷中糖的端基信号在89-100ppm。该信号位移特征