第二章酶促反应动力学.ppt
第二章酶促反应动力学,主要内容 1、酶促反应动力学的特点 2、均相酶促反应动力学 3、固定化酶促反应动力学 4、酶的失活动力学,2.1 酶促反应动力学的特点,2.1.1 酶的基本概念一、酶作为催化剂的共性二、酶的生物催化特性三、酶的调节功能2.1.2 酶的稳定性及应用特点一、酶的稳定性二、酶的应用特点,2.1.3 酶和细胞的固定化技术,一、固定化技术的基本概念二、固定化酶的特性三、固定化细胞的特性四、酶和细胞的固定化技术,2.1.4 酶促反应的特征,一、优点：常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应；与一些化学反应相比，省能且效率较高；专一性好；反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制等。二、不足，多限于一步或几步较简单的生化反应过程；一般周期较长。,2.2 均相系酶促反应动力学,2.2.1 酶促反应动力学基础一、零级反应 二、一级反应即酶催化AB的过程,三、二级反应，即A+B C,对于连锁反应，如，,2.2.2 单底物酶促反应动力学,一、米氏方程 efree S x efree P根据质量作用定律，P的生成速度可表示为,三点假设1、底物浓度S 远大于酶的浓度efree，因此x的形成不会降低底物浓度S，底物浓度以初始浓度计算。2、不考虑P+E ES这个可逆反应的存在。要忽略这一反应，必须是产物P为零，换言之，该方程适用于反应的初始状态。3、ES E+P是整个反应的限速阶段，也就是说E+S=ES的可逆反应在初速度测定时间内已达到平衡。ES分解生成产物的速度不足以破坏这个平衡。,式中rs为底物消耗速度（负号表示减少）；rp为产物生成速率；Ks为平衡常数,其又称饱和常数（saturation constant）。,利用稳态法获得米氏方程，同样基于三点假设。其中第（1）和（2）两点与快速平衡法一致，第三点是在基于底物浓度比酶的浓度高得多，中间复合物ES分解时所得到的酶又立即与底物结合，使中间复合物浓度维持不变。即在这段时间里，x的生成速率与x的消失速率相等，达到动态平衡，即所谓“稳态”。,在实际的酶促反应中，人们关心的是反应时间与底物转化率的关系所以，基于t=0，S=S0初值积分得,谢 谢 大 家,第二章 酶促反应动力学,2.1 酶促反应动力学的特点,2.1.1 酶的基本概念2.1.2 酶的稳定性及应用特点 酶是以活力、而不是以质量购销的。酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。,经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。,2.2 均相酶促反应动力学2.2.1 酶促反应动力学基础可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。对酶促反应，有：,式中，k：酶促反应速率常数；r：酶促反应速率；rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率；rP：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率。,对连锁的酶促反应，,2.2.2 单底物酶促反应动力学2.2.2.1 米氏方程 根据酶底物中间复合物假说，对单底物酶促反应，其反应机制可表示为：,快速平衡法推导动力学方程：几点假设：（1）CSCE，中间复合物ES的形成不会降低CS。（2）不考虑这个可逆反应。（3）为快速平衡，为整个反应的限速阶段，因此ES分解成产物不足以破坏这个平衡。,解之，得,令,则,根据假设建立动力学方程,稳态法推导动力学方程：几点假设：（1）CSCE，中间复合物ES的形成不会降低CS。（2）不考虑这个可逆反应。（3）CSCE中间复合物ES一经分解，产生的游离酶立即与底物结合，使中间复合物ES浓度保持衡定，即。,解之，得,令,则,根据以上假设，可建立如下方程组,米氏方程,图21 酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响,对米氏方程的讨论：当CSKm时，属零级反应。当CSKm时，。Km在数量上等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。,双倒数法(Linewear Burk):对米氏方程两侧取倒数，得,以 作图，得一直线，直线斜率为，截距为,根据直线斜率和截距可计算出Km和rmax。,图22 双倒数法求解Km和rmax,2.2.2.2 抑制剂对酶促反应速率的影响 失活作用 抑制作用 竞争性抑制 非竞争性抑制,竞争性抑制 非竞争性抑制,竞争性抑制反应机理：,快速平衡法推导动力学方程：,解之，得,，,式中:,采用稳态法推导动力学方程：,解之，得,式中:,非竞争性抑制反应机理,快速平衡法推导动力学方程,解之，得,式中:,稳态法推导动力学方程：,解之，得,式中:,竞争性抑制 非竞争性抑制,令,可变形为:,可变形为:,令,竞争性抑制 非竞争性抑制,CI=0,CI,产物抑制：酶促反应中，有时随产物浓度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶的结合，从而降低了酶促反应的速度。,反应机理：,快速平衡法推导动力学方程:,解之,得,式中:,稳态法推导动力学方程:,解之,得,式中:,可见,产物抵制属于竞争性抵制,底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底物抑制。,CS,底物抑制反应机理：,快速平衡法推导动学方程：,解之,得,式中:,2.2.3 多底物酶促反应动力学,一般的多底物酶促反应可表示为：,这里讨论：双底物双产物情况,反应机制：,关键问题：底物A、B哪个先和酶结合？任何一个都有可能先与酶结合（随机机制）A先与酶结合或B先与酶结合 两底物同时与酶结合（可能性极小）,随机机制（分支机制）,（不形成三元复合物）反应模型,EA,E,A,A,P,P,B,B,EQ,Q,Q,E,EG,（EG：修饰过的酶）,简单机制,双底物酶促反应动力学 反应机理：,解之，得,式中：,2.3 固定化酶促反应动力学,2.3.1 固定化酶促反应动力学基础 2.3.1.1 酶的固定化技术定义 酶的固定化技术是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料制成固相酶的技术。细胞的固定化技术:为省去从微生物（或动、植物）中提取酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物细胞、动植物细胞、组织技术。,物理吸附法 载体结合法 离子结合法 共价结合法 交联法 格子型 包埋法 微胶囊,2.3.1.2 酶和细胞固定化方法,交联法,2.3.1.3 固定化对酶性质的影响,底物专一性的改变 稳定性增强 最适pH值和最适温度变化动力学参数的变化,2.3.1.4 影响固定化酶促反应的主要因素,分子构象的改变 位阻效应 微扰效应 分配效应（可用Kp 定量描述）链接扩散效应（可定量描述）,分配系数(Kp)链接,分配系数：载体内外底物(或其他物质)浓度之比。Kp的测定：已知底物浓度(CS0)，体积(V0)的溶液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(Cs)。,2.3.2 固定化酶促反应过程分析,2.3.2.1 外部扩散过程 以表面固定化酶为例。,CS,CSS,外扩散过程分析,外扩散速率：,达到平衡时，,即,酶促反应速率：,Da准数:,当 时，过程为外扩散控制。当 时，过程为反应控制。,式中:,表明C*为Da准数的函数，即,(时,),表明,为C*的函数，即,可见，Da准数是决定效率因子 和比浓度C*的唯一参数，因而是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。Da准数越小，固定化酶表面浓度越接近于主体浓度CS，越接近于1。Da准数越大，固定化酶表面浓度越趋近于零，越小，越趋近于零。,为提高固定化酶外扩散效率,应设法减小Da准数。减小Da准数的措施：1、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面积，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径。2、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大。,2.3.2.2 内部扩散过程,具有大量内孔的球形固定化酶颗粒,R,dr,r,内扩散效率因子,稳定状态下，对底物进行物料衡算：,流入量流出量反应量,整理,得,两侧同除,得,当反应符合米氏方程规律时，,故,令,上式可转化为无因次形式，得,边界条件:,该微分方程无解析解，只能用数值法求解。,西勒准数(),的物理意义是表面反应速率与内扩散速率之比。对各类反应动力学与固定化酶的形状，普遍化的的定义式为:,引入无因次参数，则,无解析解，只有数值解。,见教材33页图2-10,内扩散效率因子in 是 和的函数。对in影响不大，影响in的主要参数是西勒准数。如果，则 不随变化，近似等于1，也就是说没有内部传质阻力，若，则，反应为内扩散所限制。,为提高固定化酶内扩散效率，应设法减小。减小的措施主要是适当降低固定化酶颗粒粒径。,2.4 酶的失活动力学,2.4.1 未反应时酶的失活动力学,2.4.1.1 一步失活模型 式中:E具有活性的酶，D失活的酶。kd失活反应速率常数。,建立酶失活动力学方程：,边界条件：积分，得,几个概念：,：一步失活常数：半衰期，当：时间常数，三者关系：,2.4.1.2 多步失活模型,多步串联失活模型：同步失活模型：式中，为失活速率常数为 的酶组分的分率。因此，,2.4.1.3 温度对酶失活的影响,式中，指前因子 反应活化能,同时考虑温度和时间对酶失活的影响：（见教材35页图2-11）,2.4.2 反应中酶的热失活动力学,看图：图2-12（a)说明：图2-12（b)说明：,2.4.2.1 反应中酶的失活模型,建立失活动力学方程：,方程联立求解，得,式中：,讨论：,1时，底物对酶失活无影响。0时，酶完全被底物所保护。01时，底物加速酶的失活。因此称为底物对酶稳定性影响系数。,
