第五章细胞因子.ppt

第五章 细胞因子（Cytokines）,第一节 细胞因子的概述,一、细胞因子的概念,机体的免疫细胞和非免疫细胞能合成和分泌小分子的多肽类因子，它们能调节多种细胞生理功能，称为细胞因子（Cytokines）。细胞因子包括淋巴细胞产生的淋巴因子和单核巨噬细胞产生的单核因子等。研究细胞因子有助于阐明分子水平的免疫调节机制，有助于疾病的预防、诊断和治疗，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍以及自身免疫病等已收到初步疗效，具有非常广阔的应用前景。,二、细胞因子的种类,白细胞介素（interleukin，IL）,将介导白细胞间相互作用的一些细胞因子命名白细胞介素（IL）。许多IL不仅介导白细胞相互作用，还参与其它细胞的相互作用，如：造血干细胞，血管内皮细胞，纤维母细胞，神经细胞，成骨和破骨细胞的相互作用。目前已发现IL-1，IL-2，IL-318，有20种以上。,白细胞介素的主要作用是：,促使T和B细胞增殖和分化增强NK细胞以及单核细胞的杀伤活性刺激造血细胞参与炎症反应诱导抗体的产生促进血小板的生成等,集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）,一些细胞因子可刺激不同的造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落，被称为集落刺激因子（CSF），按其作用范围分为：粒细胞CSF（G-CSF），巨噬细胞CSF（M-CSF），粒细胞和巨噬细胞CSF（GM-CSF）和多集落刺激因子（multi-CSF，IL-3）等。,集落刺激因子,广义上，凡是刺激刺激造血细胞的细胞因子都可以统称为CSF，如刺激红细胞的红细胞生成素(erythropoietin,Epo)，刺激造血干细胞的干细胞因子(stem cell factor,SCF)，刺激胚胎干细胞的白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),干扰素（interferon，IFN）,1957年，Alick Isaacs和Lean Lindernmann利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时发现受到病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其它细胞时能干扰感染病毒的复制，因而将其命名为干扰素(interferon，IFN)1。它是人和动物细胞受到适宜的刺激时产生的一种微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白。目前干扰素的一般定义为：由干扰素诱导剂作用所产生的、使其它临近细胞获得抗病毒和抗肿瘤能力的一种蛋白质。,干扰素,IFN除有抗病毒作用外，还有抗肿瘤，免疫调节，控制细胞增殖及引起发热等作用。,肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）,TNF是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，分为两种：TNF-和TNF-，前者由单核巨噬细胞产生，又称恶液质素(cachectin)，后者由活化的T细胞产生，又称淋巴毒素(lymphotoxin)。,淋巴因子（lymphokine）,由活化的淋巴细胞产生的细胞因子，都可称为淋巴因子。如IL-2,3,4,5,6,9,10,11,12,13,TNF-，IFN-等均为淋巴因子。,单核因子（monokine）,由单核巨噬细胞产生的细胞因子统称单核因子。如IL-1,6,8,TNF-，IFN-等均为淋巴因子。,三、细胞因子的作用特点,作用特点：,天然细胞因子是由细胞产生的 正常的静息或休止状态的细胞必须经过激活后，才能合成分泌细胞因子，细胞被激活后6-8h出现，24-72小时达到最高。,细胞因子的产生和作用具有多向性 单一刺激如抗原，丝裂原，病毒感染等可使同一种细胞分泌多种因子，而一种细胞因子可由多种不同类型的细胞产生。,作用特点：,细胞因子的合成和分泌是一种自我调控的过程。细胞因子是低分子量分泌型蛋白质（15-30KD之间）。细胞因子需与靶细胞上的高亲和力受体特异结合后，才发挥生物学效应。具有极强的生物学效应，细胞因子在PM（10-12M）水平就能发挥显著的生物学效应。,作用特点：,单一细胞因子具有多种生物学活性，多种细胞因子也常具有某些相同的生物学活性。主要参与免疫反应和炎症反应。以非特异性方式发挥生物学作用且不受MHC限制。某种细胞因子对靶细胞作用的强弱取决于细胞因子的局部浓度，靶细胞的类型，和同时发挥作用的其它因素。,作用特点：,天然细胞因子大多是在近距离发挥局部作用。细胞因子的作用并不是孤立存在的，它们之间通过合成分泌的相互调节，受体表达的相互调控，生物学效应的相互影响而组成细胞因子网络。,第二节 细胞因子的结构及其受体,细胞因子的结构,不同细胞因子之间在结构上有很大差异，多数细胞因子为小分子多肽，分子量不超过60KD，绝大多数因子带有糖基，糖基多与细胞因子的生物活性无关，可能起延长细胞因子体内半衰期的作用。,细胞因子的受体,细胞因子都是通过与靶细胞表面高亲合力的特异性受体结合，结合后才能发挥其生物学效应的。作为膜表面受体分为3个功能区，膜外区跨膜区膜内区,细胞因子的受体,按细胞因子受体膜外区的氨基酸序列，可将其主要分为三个受体家族：造血生长因子受体家族Ig超家族干扰素受体超家族,heptapeptides in PIII coat proteins of positive phage clones selected from the peptide library,Fig.Immunohistochemical staining of WISH cells bound with the positive phage clone 29 and 35.,Fig.Competitive binding inhibition between GFP-IFN-2b and WISH cells by synthetic peptides.,第三节 细胞因子的生物学活性,细胞因子具有广泛的生物学活性，能促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。,一、免疫细胞的调节剂,细胞因子是传递这种调节信号必不可少的信息分子，许多免疫细胞可以通过分泌细胞因子产生调节单核巨噬细胞功能和自身调节功能。,二、免疫效应分子,在免疫细胞针对抗原行使免疫效应功能时，细胞因子是其中重要效应分子之一。与抗体和补体的免疫效应分子相比，细胞因子的免疫效应功能特点是作用强，持续时间短，主要为非抗原特异性作用，参与细胞免疫功能。在抗肿瘤，抗细胞内寄生感染，移植排斥等功能中起重要作用。,例如：,TNF 和INF-可直接造成肿瘤细胞的凋零（apoptosis），使瘤细胞DNA断裂，细胞萎缩死亡。干扰素、可干扰各种病毒在细胞内的复制，从而防止病毒扩散。LIF可直接作用于某些髓性白血病细胞，使其分化为单核细胞，丧失恶性增殖特性。,三、造血细胞刺激剂,可明显刺激造血细胞集落的大小和数量。,四、炎症反应的促进剂,炎症是机体对外来刺激产生的一种病理反应过程，症状表现为局部的红肿热痛，病理检查可发现有大量炎症细胞，如粒细胞，巨噬细胞的局部浸润和组织坏死，在这一过程中，一些细胞因子起到重要的促进作用。如IL-1，IL-6，IL-8，TNF等可促进炎症细胞的聚集，活化和炎症介质的释放，可直接刺激发热中枢引起全身发烧，加重炎症。,五、其它,许多细胞因子除参与免疫系统的调节效应功能外，还参与非免疫系统的一些功能。例如，IL-8具有促进新生血管形成的作用，M-CSF可降低血胆固醇。IL-1刺激破骨细胞，致骨细胞的生长等。,第四节 细胞因子的临床意义,一、细胞因子与疾病,细胞因子及其受体的缺陷 细胞因子表达过高 可溶性细胞因子受体水平升高,细胞因子及其受体的缺陷,如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染并破坏TH后，可导致TM细胞产生的各种细胞因子缺陷，免疫功能全面下降，从而表现出获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的一系列症状。,细胞因子表达过高,在炎症，自身免疫病，变态反应，休克等疾病时，某些细胞因子的表达量可成百上千倍地增加，而这些细胞因子均可促进炎症过程，使病情加重，应用细胞因子的抑制剂有可能治疗这类炎症性细胞因子水平升高的疾病。,可溶性细胞因子受体水平升高,细胞因子受体从细胞膜上脱落下来，存在于体液和血清中，使可溶性细胞因子受体水平升高。这类分子可能结合细胞因子，使其不再与膜表面受体结合，因而封闭了细胞因子的功能。,二、细胞因子与治疗（cytokine therapy）,目前利用基因工程技术生产重组细胞因子，作为生物应答调节剂（BRM）治疗肿瘤，造血障碍，感染等已收到良好疗效，成为新一代的药物。,细胞因子补充和添加疗法,IFN：IFN主要用于治疗病毒性感染和肿瘤。对病毒性肝炎，疱疹性角膜炎，带状疱疹，慢性宫颈炎等有较好疗效。IL-2：目前多将IL-2与LAK/TIL合用治疗实体肿瘤，对肾细胞瘤，黑色素瘤，非何杰金淋巴瘤，结肠直肠癌有较显著的疗效。TNF：局部应用，全身应用副作用严重。CSF：用于各种粒细胞低下患者，如化疗后的辅助治疗。,细胞因子阻断和拮抗疗法,其基本原理是抑制细胞因子的产生和阻断细胞因子与其相应受体的结合及受体的信号传导过程，使细胞因子的病理性作用难以发挥该疗法适用于自身免疫疾病，移植排斥反应，感染性休克等的治疗。,三、细胞因子的检测,细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标，在疾病的诊断，病程观察，疗效判断及细胞因子治疗监测方面有重要意义。,目前的检测方法：,依赖性细胞株一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，因而可利用这些依赖细胞检测相应的细胞因子。功能检测利用一些细胞因子的功能，建立相应的活性测定方法。免疫测定 利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，可进行免疫检测。,目前的检测方法：,功能测定与抗体抑制所用的抗细胞因子抗体必须是具有中和活性的抗体。分子杂交技术制备出细胞因子的基因探针，通过分子杂交技术检测细胞内细胞因子mRNA的表达。多聚酶链反应技术（ploymerase chain reaction，PCR）首先将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增。,免疫学相关的生物高技术药品,细胞因子,细胞因子是一组多肽或低分子量蛋白质，包括干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）、转化生长因子（TGF）等。它们与靶细胞特异受体结合，调整细胞增殖、分化和功能活性，在神经内分泌、免疫调节网络中起重要作用。,干扰素是一种诱生蛋白，正常细胞一般不会自发产生干扰素，只存在着合成干扰素的潜能，其编码基因处于被抑制的沉默状态。在诱导剂的存在下，干扰素基因才获得表达。目前已知所有的哺乳动物基本上都可产生干扰素。根据动物的来源不同，可将干扰素分为人干扰素（HuIFN）、小鼠干扰素（MuIFN）、猪干扰素（PoIFN）和牛干扰素（BoIFN）等。根据其氨基酸组成、抗原性和细胞来源，又可将干扰素分为两个型2。,干扰素的产生与分类,干扰素的产生与分类,I型干扰素有IFN-、IFN-、IFN-、IFN-和IFN-。其中IFN-为多基因产物，分为许多亚型，分别命名为1、2、3主要由白细胞产生；IFN-主要来自成纤维细胞，它们与IFN-有相似的生物学活性，结合同样的受体，统称为I型干扰素。IFN-属于II型干扰素或免疫干扰素3，主要由T细胞和NK细胞产生，其理化特性和生物学活性与I型干扰素有明显的不同，如I型干扰素可耐受pH2.0的酸处理，而II型干扰素在pH2.0的条件下很快失活。此外，II型干扰素在调节免疫应答，抗增殖方面的活性较强，而抗病毒活性则较弱。,干扰素（IFN）,IFN分、三型，并有多种亚型，进入临床的重组产品已有11个。IFN对病毒有直接杀伤作用，影响癌基因表达，抑制癌细胞分裂、增殖和转移。治疗毛细胞白血病、原发性血小板增多症和慢性髓细胞白血病等效果较好。近来FDA批准IFN-2b用于慢性丙型、乙型肝炎，有效率40%50%，受到欢迎。近2年日本年销售额增到12亿16亿美元。,干扰素,常见副作用有一过性发热、寒战、体重下降、肌肉酸痛，有报道可诱发狼疮样自身免疫病。剂量在500万1000万U，几乎所有患者都有轻度副反应，约5%患者不得不停止治疗，基因工程IFN副作用少、活性强，国产-1bIFN、-2bIFN已经上市，副作用较小。,I型干扰素分子结构,研究发现，IFN-一般以6聚体形式存在，而且其中每一个单体是由5个螺旋和4个环状结构组成。A(残基623)、B(4956)、C(7791)、D(112131)和E螺旋(135155)以及AB环（2935）、BC环（6878）、CD环（100114）和DE环（133140）,I型干扰素受体的研究进展,人I型IFN受体基因定位于第21号染色体上，分布于细胞表面，至少含有两个亚单位，命名为IFNAR1和IFNAR2，它们属于II类细胞因子受体家族。IFN-/通过吸附细胞表面受体IFNAR1和IFNAR2发挥作用，蛋白酪氨酸激酶中的Tyk2和Jak1分别与IFNAR1和IFNAR2相关。,IFNAR1（亚单位）,1990年Uze等人成功克隆了第一个受体亚单位IFNAR1。人IFNAR1是由包含21个氨基酸转膜片段和100个氨基酸胞浆区域的共557个氨基酸的糖蛋白组成，相对分子质量是约为110130KDa。IFNAR1的胞浆区域含有四种可能是Jaks或其他激酶作用目标的酪氨酸(Tyr466，Try481，Try527，Try538)。研究表明，I型IFN与受体的结合快速激活了亚单位的酪氨酸磷酸化。,IFNAR2（亚单位）,1994年I型IFN受体的IFNAR2被克隆，有可溶和跨膜两种形式。相对分子质量接近90100KDa。IFNAR2有三种由相同基因可选择剪切产生的类型：IFNAR2a(S短型体)，IFNAR2b(可溶型)和IFNAR2c(L长型体)。长型体(L)和短型体(S)通过胞外和跨膜区域以及胞浆区域的第一个15个氨基酸来区分。,IFN-/引起的Jak-STAT信号传递途径,I型IFN与其受体结合后，胞浆中的Stat蛋白P84/P91和Pll3进行酪氨酸（Tyr）磷酸化，并与胞浆中的48KDa蛋白(P48)结合，形成IFN-的基因因子(ISGF3)复合体，ISGF3迅速易位于细胞核中，并与顺式激活IFN刺激反应元件ISRE结合，从而激发它们的翻译。两种胞浆中蛋白酪氨酸激酶，Tyk2和Jak1均是将ISGF3的亚单位磷酸化的酶。,IFN的抗病毒作用,干扰素抗病毒具有广谱性，但它对细胞抗病毒作用是间接的，而且是非特异性的。当干扰素与细胞表面的干扰素受体结合后，可诱导细胞内产生具有酶活性的抗病毒蛋白（Antiviral Protein，AVP）。已知的AVP至少有三种：蛋白激酶、磷酸二脂酶和2-5腺苷酸合成酶，其中前两种能破坏细胞核糖体翻译病毒蛋白，后一种酶能降解病毒的mRNA。AVP还能抑制转录酶的活性，阻止mRNA的合成，以及抑制病毒DNA的合成。因此可以说干扰素是通过AVP间接的抑制病毒增殖从而达到抗病毒的作用。,IFN的抗肿瘤作用,干扰素的抗肿瘤主要表现在：连续使用干扰素能抑制肿瘤的增殖，显示出抑瘤效果；抑制肿瘤细胞增生，其作用随肿瘤细胞的增加而增强；干扰素能改变瘤细胞表面的性能，诱发新的抗原，从而易被免疫监视细胞识别并加以排斥；通过免疫调节，增强机体抗肿瘤能力。因此，干扰素的抗肿瘤作用主要是通过促进机体免疫功能，提高巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的杀伤水平而达到目的。,IFN的免疫调节作用,干扰素可增加免疫球蛋白G（IgG）Fc受体的表达，从而有利于巨噬细胞对抗原的吞噬，K细胞、NK细胞对靶细胞的杀伤以及T、B淋巴细胞的激活，增强机体的免疫应答能力。I 型干扰素可增加MHC-I分子的表达，从而增强了细胞毒性T细胞对这类靶细胞的杀伤效应，同时增加NK细胞裂解能力，使机体能够有效地抵抗病毒感染和提高抗肿瘤免疫。IFN-可增加细胞表面MHC-II类分子的表达，调节巨噬细胞、T细胞和B细胞之间的关系，增加免疫应答能力。,白细胞介素（IL）,IL 可作为免疫刺激剂，有抗肿瘤作用，但临床试验为数有限，目前已发现IL122，IL1-18是用传统方法发现的，其中IL-1、2、4、5有抑制肿瘤活性作用。IL-2治疗恶性黑色素瘤和肾细胞癌有效，尽管有严重的副作用，但终因可使15%肾癌缩小、4%消失而在美国获准。IL-3增加恶性肿瘤及骨髓抑制患者的白细胞和血小板数量。IL-12是NK细胞活性刺激因子，IL-13可能有抗癌、抗炎及抗HIV活性。,白细胞介素,现正以IL-2为原型开发类似物治疗癌症和难治的慢性传染病。IL拮抗物、IL-毒素络合物，可溶性IL受体的研究将提供新的免疫抑制剂，治疗移植排斥、自身免疫病和变态反应。,肿瘤坏死因子（TNF）,TNF 由巨噬细胞产生的，对瘤细胞有杀伤作用而对正常细胞无细胞毒作用的因子。它直接抑制增殖，引起细胞坏死，并损伤肿瘤血管。动物实验对肉瘤、腺瘤有效，并对化疗、热疗有协同作用，引起国内外重视。但疗效并不满意，加大剂量则损伤肝脏和引起低血压。有人探索与其它药物合用，或内、外源性TNF合用取得一定效果，也有用分子生物学技术研制变型TNF，以增强抗瘤作用，降低副作用。,集落刺激因子（CSF）,CSF 有G-CSF和GM-CSF，是来源于巨噬细胞、内皮细胞等的糖蛋白，刺激粒细胞系的祖细胞增殖、分化和活化，使之成为成熟的中性粒细胞。具有以下三种作用：动员骨髓中中性粒细胞移行至外周血中。促进骨髓中性粒细胞前体分化和增殖。增强中性粒细胞的功能。其中以第二种作用最为重要。,集落刺激因子,单用或与其他造血生长因子合用治疗多种疾病如再障、重症感染、烧伤、AIDS以及单用或与抗生素合用预防术前术后感染都可能是前景良好的新疗法。而且人体对CSF有良好的耐受性。目前癌症患者中进行的II期研究已表明，患者接受治疗后，其中性粒细胞减少的持续时间缩短了46倍。如在化疗的同时辅以CSF治疗使中性粒细胞从化疗时最低水平迅速恢复到正常水平。,集落刺激因子,GM-CSF和IL-3促进造血作用相似，作用时相上互补，有人将二者的cDNA连接，产生融合分子，活性大为提高。CSF另一重要作用即为抗感染。用之预防可使动物的存活率达100%。和抗生素配伍用可使感染动物3d存活率达91%，而单用抗生素其存活率仅为28%。,体细胞治疗制品,体细胞治疗,体细胞治疗：应用人的自体、异体或异种细胞，经体外操作后回输或植入体内。体外操作包括细胞的传代、扩增、筛选或其它改变细胞生物学行为的处理。这些细胞制品主要用于：细胞的输入或植入，旨在体内释放某些因子，如酶、细胞因子、凝血因子等。输入激活的淋巴细胞，如淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK细胞）或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），以期杀伤肿瘤细胞。植入经体外操作的细胞群，如肝细胞、肌细胞、胰岛细胞、在体内发挥生物学作用。,体细胞治疗,目前以细胞转移治疗报道较多，从患者身上取出免疫系统细胞，用细胞因子（常用IL-2）刺激，以提高天然细胞毒活性，再将它们与细胞因子共同输回患者体内。已知抗肿瘤作用的细胞群有LAK细胞、肿瘤抗原特异性杀伤细胞（CTL）、NK细胞等。输入LAK细胞并继续给予IL-2，在临床上看到抗肿瘤效果。从胰腺癌腹水中分离CTL细胞，用自身肿瘤细胞刺激，建立针对自身肿瘤特异性的CTL细胞克隆，对瘤细胞有杀伤活性。,体细胞治疗,美国加州应用免疫科学公司从6名AIDS患者中提取淋巴细胞，在实验室提纯，用IL-2或PHA培养23周，再把这些淋巴细胞浓缩重新输注进每个患者体内，5个月治疗5个周期，使晚期AIDS患者中2例卡波氏肿瘤、3例白斑病、4例念珠菌病、1例蛇皮癣症有明显疗效。基因工程技术可使体细胞治疗导向更多的病种，如可增加继承性免疫效果，为治疗遗传性和获得性肌病及血友病、癌症和心脏病等提供新的途径。,基因治疗制品,基因治疗,基因治疗指改变人活细胞遗传物质的治疗方法。按基因导入人体的途径分两大类：直接法：即将外源性功能基因以逆转录病毒、质粒载体或脂质体类包囊，或将裸露DNA的形式直接注入体内，让基因在体内表达。间接法：即将受体细胞（例如淋巴细胞、骨髓干细胞、皮肤或纤维细胞等）在体外培养导入外源性功能基因，然后把这种经遗传修饰的受体细胞输回或移植入患者体内，让外源基因表达。,基因治疗,美国NIH重组DNA咨询委员会到现在已批了40多项，典型的基因治疗用于遗传、免疫病。如向囊性纤维变（CF）患者肺中导入CF跨膜调节基因；向肝细胞插入LDL受体基因，再输入肝脏，治疗家族性高胆固醇血症的人体试验已成功。美国Viagene公司研究出一种被称为艾滋病毒免疫制剂，该药为一种鼠逆病毒与核心蛋白编码的基因序列和HIV表面抗原RNA结合产物。HIV抗原则可使人体免疫系统去袭击受HIV感染的细胞。在小鼠、灵长类试验中确定该药能诱导出强的HIV-特异性杀伤细胞。,基因治疗,基因治疗用于癌症已是十分活跃的研究领域。将特殊的淋巴细胞因子编码基因导入自体或同种瘤细胞，再种到患者体内。实验证明能增强免疫应答，对原发性瘤有效。还有人研究将肿瘤抑制物导入人或动物肿瘤，且看到效果。目前试验一种更简单、快速的方法，即DNA注射法。DNA作为一种药物注射，无需从体内取出细胞、改变遗传特性的处理过程。注射的DNA起免疫系统催化剂的作用，使免疫系统识别并攻击瘤细胞，不仅直接影响注射部位，且可作用远处转移瘤。,下一堂课的内容为“免疫细胞膜分子”,