第二部分细菌感染实验诊断.ppt

第二章细菌感染实验诊断,疾病的种类不断发生变迁，传染病如鼠疫等已明显减少，相反，由条件致病菌引起的内源性感染却明显增多。同时，新的病原菌不断出现，原有的病原菌因变异、耐药等又重新流行。,目前，临床遇到主要是条件致病菌，引起的感染。正常菌群与病原菌的致病性是相对的，因此，既不要轻易认为分离出的非致病菌是污染菌，也不要轻易认为所发现的细菌就是该感染的病原菌，必须结合临床进行进一步的诊断。,第一节 临床感染性疾病 实验诊断要求,一、诊断的目的 1.以疾病的病原学诊断为目的,只需鉴 定到细菌的种。2.为提供治疗方案为目的，要进行临 床标本的直接药物敏感试验。,3.以流行病学研究为目的,要鉴定到型。4.以了解细菌与感染的关系为目的,应 该做细致的鉴定。,二、诊断试验的选择,1.选择有鉴定价值的试验。2.选择简易、快速、方便的试验，达 到目的即可。,3.综合考虑试验的敏感性和特异性。敏感性=阳性结果数/感染病人数，越高假阴性就越少。特异性=阴性结果数/未感染病人数，越高假阳性就越少。,三、常用诊断流程,1.双歧索引用于相互区别比较容易,有特征的细菌，如革兰阴性杆菌初步分群；对于相互区别较难的细菌，鉴定项目较多,用起来不太方便。,2.表解法：将各种细菌及其多种特性列成矩阵表格，使相互的区别点十分明显，便于分析比较。此法对于相互区别比较复杂的细菌，如肠杆菌科的初步分属。,3.数字编码鉴定法,将所得生化反应模式转化成数学模式，可把细菌生化反应结果转化成数字，经检索手册又可将转化成细菌名称。与电脑分析软件配套，形成了半自动或全自动细菌分析系统。,第二节 临床标本的采集 与处理,一、标本采集的一般原则 1.病程早期、急性期或症状典型时，使用抗生素前。2.无菌采集 应无污染，严格进行无 菌操作。,3.根据目的菌的特性用不同的方法采集 适量标本，采集量不应过少。4.注意在不同病程采集不同部位标本。5.采集标本时要防止传播和自身感染。,二、标本的处理,1.标本保存在4环境中，在2h之内送检。脑脊液则要在25 保存，用于细菌培 养的标本保存时间不应超过24h。对环 境敏感的细菌应保温并立即送检。,2.标本中可能含有致病菌，必须注意安全 防护。切勿污染环境。对于烈性传染病 标本运送时更要由专人运送，严格按规 定包装。,3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管 内运送，有时可直接用抽取标本的注射 器运送。,第三节 细菌形态学检查,一、显 微 镜 1.普通光学显微镜用油镜放大1000倍，一般细菌 均能清 楚看到。2.暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和螺旋 体的形态及运动观察。3.相差显微镜主要用于检查不染色活细菌的形态 及某些内部结构。,4.荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用 于免疫荧光技术中。5.电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显 微镜。前者适于观察细菌内部超微结构，后 者适于对细菌表面结构及附件观察。,二、不染色细菌标本检查,1.主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。可对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱菌。2.螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。,三、细菌染色标本的检查,细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类。,(一)常用染料,分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合染料。1碱性染料 电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌 均带负电荷，易与染料结合而着色。常 用的有碱性复红、结晶紫、美蓝等。,2酸性染料 电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。细菌都带有负电荷故不易着色。通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。,3复合染料(中性染料)及荧光染料 复合染料是碱性染料和酸性染料的 复合物，如瑞氏染料(伊红美蓝)、姬姆萨染料(伊红天青)等；荧光染 料如荧光标记的抗体，荧光素常用 异硫氢基荧光素。这些染色常用于 某些特殊的染色技术中。,（二）常用的染色方法,在细菌感染标本的检查中，临床上常用的染色方法有革兰染色、抗酸染色和荧光染色。,1革兰染色,最经典、最常用的染色方法。在分离培养前都要进行革兰染色、镜检。通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，有助于进一步鉴定。,结合细菌特殊结构及排列方式，对病原菌可进行鉴定，其结果为临床早期诊断及治疗提供了依据。革兰染色可为临床选择用药提供参考，帮助临床制订有针对性的治疗方案。因为G+菌和G-菌对抗生素敏感性不同，且致病物质 及其作用机理也不同。,2抗酸染色,将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两大类。因为大多数病原菌为非抗酸性，所以抗酸染色不作为常规检查项目。只用于结核病等检查。抗酸染色的鉴定结果。对疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。,3荧光染色 敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。此外还有：鞭毛染色可观察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中很重要。异染颗粒染色镜检异染颗粒，为临床早期诊断白喉提供依据。,第四节细菌分离培养与接种技术,绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。,（一）细菌室的符合条件,1细菌室必须安装严密的门窗，以防室 内环境受到外界的污染。且室内禁用 风扇，避免细菌的播散。2细菌室必须安装供空气消毒的紫外线 灯，置于操作台上面lm处，每天开始 工作前照射 20min。对其消毒效果要 定期检查，及时更换失效的灯管。,3室内应备有消毒剂，用于试验中发生 菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还 应备有供工作人员浸手用的盛有消毒 剂的水盆、肥皂及自来水源等。4室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地 面至少一周用消毒剂擦洗1次。,5对接收的标本、无菌器具、用过的物 品等应明显分开井放在指定位置。同 时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6细菌室应有当地的气温特点的消防设 备。,(二)无菌实验室,1无菌室应完全封闭，人员出入应 有两道门，其间应隔有 缓冲区。2用前应以紫外线消毒30min，定期 用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。,3在无菌室中一般仅限于分装无菌的 培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。4无菌室内应仅限操作人员进人，而且 进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操 作时戴口罩，随时保证室内的无菌状 态。,5条件有限的实验室，可用超净工作台 代替无菌实验室进行相应的操作。超 净工作台应选择垂直气流通风方式。6无菌室应配备空调设备，保证不因室 温而影响工作。,(三)基本设备和器具,用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；,用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。,二、培 养 基,由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、生化特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。,(一)培养基的组成成分,1.营养物质:(1)蛋白胨；(2)肉浸液；(3)牛肉膏；(4)糖类；(5)血液；(6)无机盐类；(7)鸡蛋和动物血清；(8)生长因子：提供细菌生长繁殖所需要的氮源和碳源，还有生长因子。2.凝固物质 制备固体培养基时，加入琼脂，琼脂是半乳糖胶，98以上时可溶于水，在45 以下则凝固成凝胶状态。3.抑制剂和指示剂 用于选择、鉴定及判断结果。,(二)培养基种类,1基础培养基 含有生长所需的基本营 养成分，称肉汤，用于增菌、检验，是制备其他培养基的基础成分。2营养培养基 在基础培养基中可加入 葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生 长因子的细菌生长。最常用的是血平 板等。,3鉴别培养基 利用细菌分解能力及代 谢产物的不同，在培养基中加入特定 的作用底物和指示剂，观察细菌生长 过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。如糖发酵培养基。,4选择培养基 在培养基中加入抑制剂而 抑制杂菌生长，有助于对所选择的细菌 生长。5特殊培养基包括厌氧培养基和细菌L型 培养基等。,(三)分离培养基的选择,依据卫生部临床检验中心推荐，应备有 如下分离培养基：1血平板 适于各类细菌的生长。2巧克力血平板 其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的 标本。,3中国蓝平板或伊红美蓝平板 有选择地 促进G_菌生长，是较好的弱选择性培养 基。4麦康凯平板 具中等强度选择性，是非 发酵菌鉴定的依据。5SS琼脂 有较强的抑菌力，用于志贺菌 和沙门菌的分离。,6碱性琼脂 用于从粪便中分离霍乱弧菌 及其它弧菌。7血液增菌培养基 用于从血液、骨髓中 分离常见病原菌。8营养肉汤 用于标本及各类细菌的增菌。,三、细菌接种与分离技术,(一)平板划线分离法 1连续划线分离法 此法主要用于 杂菌不多的标本。2分区划线分离法 本法适用于杂 菌量较多的标本。获得单个菌落。,(二)斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。(三)液体接种法 多用于一些液体生化试验管的接种。(四)穿刺接种法在试管内壁与液面交接处 的此法主要用于半固体培养基、明胶 及双糖管的接种。,(五)倾注平板法 测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数 时常用此方法。(六)涂布接种法 常用于纸片法药物敏感性测定，也可 用于被检标本中的细菌计数。,四、细菌培养方法,(一)需氧培养法 最常用的培养方法，适于需氧和兼性厌氧菌的培养。,(二)二氧化碳培养法 常以下列方法供给 C02。1二氧化碳培养箱 是一台特制的培养箱，既能调节C02的含量，又能调节所需的温度。此法适于大型实验室应用。,2烛缸法 将已接种好的培养基置 干燥器内，并放人点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂亡凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C02含量约占5-10，然后将干燥器放入35 温箱内培养。,3化学法 按每升容积加入碳酸氢钠04g和浓盐酸035ml的比例，分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放人干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成CO2。(三)厌氧培养法,第五节细菌产物的检测及鉴定,一、细菌毒素的检测(一)内毒素的测定 主要用于诊断病人是否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。,1细菌内毒素的致热作用 常以家兔作为实验动物，家兔正常体温385 40。抽取被检物注入家兔耳静脉，记录体温变化情况，分析实验结果。,2鲎试验 鲎血液的有核变形细胞内含凝 固酶原及凝固蛋白原，当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物(鲎试剂)接触时，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白，利用此种反应来检测内毒素。本试验对内毒素具有高度特异性，灵敏度高，可检查出0005 00005gml内毒素。且操作简便，速度快，在2h内即可得出结论。,(二)外毒素的测定,1体内毒力试验 细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。,2体外毒力试验 外毒素抗原性强，可刺激机体产生相应的抗体。在体外以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。如白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定。ELISA法如葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌LT及ST等的测定。,二、细菌生化反应鉴定,不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。,(一)碳水化合物的代谢试验,1糖(醇、苷)类发酵试验(1)原理：由于细菌含有发酵不同糖类的酶，故分解糖的能力不同，终末产物亦不一致。有的能分解，有的仅能分解1-2种，还有的不能分解。有的产酸产气，有的仅产酸，故可利用鉴别细菌。,(2)培养基：在培养基中加入0.5-1的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷、菊糖等)。可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。(3)方法：将细菌接种到糖发酵培养基中，培养数h小时至2w后，观察结果。,(4)结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，若产气可出现气泡或培养基内有裂隙等现象;若不分解，除有细菌生长外，无任何变化。(5)应用：是鉴定细菌最主要的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。,2氧化一发酵试验(OF试验),(1)原理：细菌分解葡萄糖必须有分子氧参加的称为氧化型；进行无氧降解的称为发酵型；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。(2)培养基HL：Hugh-Leifson二氏培养基。,(3)方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，一支滴加无菌液体石蜡，高度不少于1cm。将培养基于35 培养48h或更长。(4)结果：两支培养基均无变化为产碱型或小分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若不加石蜡的培养基产酸为氧化型。(5)应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别型或产碱型。也呵用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。,3-半乳糖苷酶试验,(1)原理：有的细菌可产生 半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-D-半乳糖苷(ONPG)，而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。,(2)试剂：O75M ONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在加入缓冲液(69g NaH 2PO4溶于45ml蒸馏水中，用30NaOH调控pH为7.0，再加水至50ml)5ml，置4冰箱中保存。,（3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37 水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min3小时观察结果。,(4)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在2030min内显色。(5)应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。,4七叶苷水解试验,(1)原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。(2)培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。,(3)方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。(4)结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。(5)应用：主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。,5甲基红试验,(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解，产生甲酸等，使pH降至45以下，加入甲基红试剂则呈红色为阳性。若分解葡萄糖产酸量少，则pH 62以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。,(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2-4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。(4)结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。,(5)应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属则为阴性。,6V-P试验,(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧氧化为二乙酰，进而与胍基起作用生成红色化合物，则为V-P试验阳性。(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。,(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35 培养48h后加入甲液(6n萘酚酒精溶液)和乙液(40KOH溶液)，振摇。(4)结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35 4h后仍如故者即为阴性。(5)应用：常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。,