chapter9核糖体(ribosome).ppt
第九章核糖体,第一节、核糖体的类型与结构第二节、多聚核糖体与蛋白质的合成,第一节 核糖体的类型与结构,核糖体是合成蛋白质的细胞器，其唯一的 功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且精确地合成多肽链。一、核糖体的基本类型与成分 二、核糖体的结构 三、核糖体蛋白质与rRNA的功能分析,一、核糖体的基本类型与成分,核糖核蛋白体,简称核糖体(ribosome)基本类型多聚核糖体游离核糖体70S的核糖体80S的核糖体主要成分r蛋白质：40%，核糖体表面 rRNA:60%,，核糖体内部,二、核糖体的结构,结构与功能的分析方法 蛋白质合成过程中很多重要步骤 与50S核糖体大亚单位相关,结构与功能的分析方法,离子交换树脂可分离纯化各种r蛋白；纯化的r蛋白与纯化的rRNA进行核糖体的重组装，显示核糖体中r蛋白与rRNA的结构关系双向电泳技术可显示出E.coli核糖体在装配各阶段中，与rRNA结合的蛋白质的类型双功能的交联剂和双向电泳分离可用于研究r蛋白在 结构上的相互关系 电镜负染色与免疫标记技术结合，研究r蛋白在核糖 体的亚单位上的定位。对rRNA，特别是对16S rRNA结构的研究 70S核糖体的小亚单位中rRNA与全部的r蛋白关系 的空间模型,同一生物中不同种类的r蛋白的一级结构 均不相同，在免疫学上几乎没有同源性。不同生物同一种类r蛋白之间具有很高 的同源性，并在进化上非常保守。,蛋白质结合到rRNA上具有先后层次性。核糖体的重组装是自我装配过程,16SrRNA的一级结构是非常保守的16SrRNA的二级结构具有更高的保守性：臂环结构(stem-loop structure)rRNA臂环结构的三级结构模型,蛋白质合成过程中很多重要步骤与50S核糖体大亚单位相关,涉及的多数因子为G蛋白(具有GTPase活性)，核糖体上 与之相关位点称为GTPase相关位点。最近人们成功地制备L11-rRNA复合物的晶体，获得了 其空间结构高分辨率的三维图象。这一结果证实了前人用各种实验技术所获得的种种结论提出直观、可靠且比人们的预料更为精巧复杂和可能的 作用机制，从而为揭开核糖体这一具有30多亿年历史的 古老的高度复杂的分子机器的运转奥秘迈出了极重要的 一步。,三、核糖体蛋白质与rRNA的功能分析,核糖体上具有一系列与蛋白质 合成有关的结合位点与催化位点 在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究,核糖体上具有一系列与蛋白质 合成有关的结合位点与催化位点,与mRNA的结合位点与新掺入的氨酰-tRNA的结合位点氨酰基位点，又称A位点与延伸中的肽酰-tRNA的结合位点肽酰基位点，又称P位点肽酰转移后与即将释放的tRNA的结合位点E位点(exit site)与肽酰tRNA从A位点转移到P位点有关的转移酶(即延伸因子EF-G)的结合位点肽酰转移酶的催化位点与蛋白质合成有关的其它起始因子、延伸因子和 终止因子的结合位点,在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究,核糖体蛋白 在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分r蛋白质的主要功能,核糖体蛋白,很难确定哪一种蛋白具有催化功能：在E.coli中核糖体蛋白突变甚至缺失对蛋白 质合成并没有表现出“全”或“无”的影响。多数抗蛋白质合成抑制剂的突变株，并非由 于r蛋白的基因突变而往往是 rRNA基因突变。在整个进化过程中rRNA的结构比核糖体蛋白 的结构具有更高的保守性。,在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分,具有肽酰转移酶的活性；为tRNA提供结合位点(A位点、P位点和E位点)；为多种蛋白质合成因子提供结合位点；在蛋白质合成起始时参与同mRNA选择性地结 合以及在肽链的延伸中与mRNA结合；核糖体大小亚单位的结合、校正阅读(proofreading)、无意义链或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等 都与rRNA有关。,r蛋白质的主要功能,对rRNA 折叠成有功能的三维结构是十分重要的；在蛋白质合成中,某些r蛋白可能对核糖体的构象 起“微调”作用；在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中,核 糖体蛋白与rRNA共同行使功能。,第二节 聚核糖体与蛋白质的合成,多聚核糖体(polyribosome或polysome)蛋白质的合成 RNA在生命起源中的地位及其演化过程,一、多聚核糖体(polyribosome或polysome),概念 核糖体在细胞内并不是单个独立地执行功能，而是由多个 甚至几十个核糖体串连在一条mRNA分子上高效地进行肽 链的合成，这种具有特殊功能与形态结构的核糖体与 mRNA的聚合体称为多聚核糖体。多聚核糖体的生物学意义细胞内各种多肽的合成，不论其分子量的大小 或是mRNA的长短如何，单位时间内所合成的 多肽分子数目都大体相等。以多聚核糖体的形式进行多肽合成，对mRNA 的利用及对其浓度的调控更为经济和有效。,三、RNA在生命起源中的地位及其演化过程,生命是自我复制的体系 DNA代替了RNA的遗传信息功能蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能RNA interference,RNAi scoops medical Nobel,Two US geneticists who discovered one of the fundamental mechanisms by which gene expression is controlled have received a Nobel prize for their achievement.Andrew Fire and Craig Mello,who revealed the process of RNA interference(RNAi)in 1998,will share the US$1.4-million award.,Nature News October 2,2006,Works of Andrew Fire and Craig Mello,Background of RNAi research,Its an branch of Reverse GeneticsHave a gene in hand(genome sequence,for example),and want to know what it does.Potentially applicable to all organisms:no breeding necessary.,RNA?,prediction:sense RNA shouldnt do anything.,Kill the messenger!,Mutant Phenotype,Inject Worms,Mutant Phenotype,Make sense RNA,Run on gel,MIX,Purify single-stranded RNA,Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA.,What is RNA interference?,RNAi的定义,RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA分子（dsRNA）在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程。dsRNA可以抑制不同类型细胞的靶向基因的表达，用特异的抗体几乎检测不到靶向基因表达的蛋白质。因此RNAi技术又被形象的称为基因敲低（knockdown）。RNAi是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing PTGS）。,其它RNAi现象：PTGS 早在1990年，Jorgensen等将带有紫色色素的基因通过转基因导入矮牵牛花(Petunia)中,以期牵牛花的颜色更加艳丽。结果花的颜色非但没有加深,而且呈现出部分甚至全部的白色,这表明导入基因和植物中内源性基因的表达同时受抑。由于这种由于外源基因的导入而造成的抑制作用最初被确认是发生在转录后水平，所以被称为“转录后基因沉寂”（posttranscriptional gene silencing）或共抑制（cosuppression）。,Quelling 类似的现象还发生在真菌中，当把合成类胡萝卜素的基因转入红色面包霉中时，导致大约30转染细胞本身基因的失活，这种现象称为“压制”（quelling）。研究发现在植物、真菌、锥虫、涡虫、囊虫、线虫、果蝇、斑马鱼、老鼠早期胚胎等不同种属的生物体中都存在这一现象。,RNAi的机制,RNAi的几个重要成员：siRNA 导入生物体的dsRNA 在ATP 供能下被Dicer 复合物切割,生成约22 个核苷酸(nu2cleotide,nt)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA）。siRNA的结构特征是：双链，长度2123nt；具有5末端磷酸基团和3末端羟基；双链两端具有两个突出的单链核甘酸。,Dicer 导入生物体的dsRNA的降解过程需要不同的酶的参与，其中一种为dsRNA特异性核酸内切酶（dsRNA-specific endonuclease，Dicer）。Dicer是RNA酶家族中dsRNA特异性核酸内切酶，具有解旋活性。它的作用底物是长度200500bp左右的dsRNA。Dicer切割dsRNA，产生2123bp的siRNA片断。此酶对小于30bp的dsRNA和ssRNA均无活性。,siRNA,dsRNA,RdRp RNAi需要的另一种酶为RNA依赖性的RNA多聚酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）。此酶的作用是以siRNA为一种特殊的引物，以靶mRNA为模板，将mRNA通过聚合酶链式反应转变成为dsRNA，为Dicer提供底物。但用blast搜索果蝇和人的基因组序列，没有发现与已知RdRp同源的序列，所以有非RdRp依赖的RNAi学说。,RISC siRNA必须与RNA诱导沉默复合物（RNAinduced silencing complex，RISC）结合才能具有切割靶mRNA的功能，siRNA是RISC的组成部分。RISC对靶mRNA的切割是以内切的方式进行的，而且切割仅发生在与siRNA同源的部分。,RNAi作用的简单模型 当dsRNA导入细胞后，被Dicer切割成2123bp的siRNA，这一加工过程需要ATP提供能量。被切割成2123bp的siRNA再与RISC结合并激活，siRNA在ATP提供的能量下解链，以它的反义链为模板识别靶mRNA，引导RISC对其进行降解，最终抑制目的基因的表达。siRNA的反义链结合到目的mRNA后，不仅诱导RISC对该基因进行降解，同时还激活RdRp介导的单链RNA的合成，产生大量dsRNA，这些dsRNA再次被RISC切割成许多siRNA，进入下一个RNAi循环。,Breakthrough:Short dsRNA(22 nt)induces RNAi,Silencing of lamin proteins in human cells by dsRNA transfection,RNAi的特点,RNAi的特异性 导入生物体的siRNA只能引起同源基因的表达抑制，而无关基因不受影响。而且，在siRNA序列中配对的2123nt中如果改变一个核甘酸，就可以使siRNA序列不对靶mRNA起作用。,RNAi的高效性 siRNA的反义链结合到目的mRNA后，不仅诱导RISC对该基因进行降解，同时还激活RdRp介导的单链RNA的合成，产生大量dsRNA，这些dsRNA再次被RISC切割成许多siRNA，进入下一个RNAi循环。这种不断放大的瀑布式作用形成大量的新的siRNA，使RNAi的在短时间内达到迅速并有效地抑制mRNA翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制了靶向基因蛋白质或多肽地合成。每个细胞只需少量的dsRNA即能完全关闭相应基因地表达，可见，RNAi过程具有生物催化反应的基本特性。,RNAi的可扩散性 Fire等观察到将dsRNA注射于线虫体内，这些dsRNA可以从注射处的细胞扩散到体内其它细胞，引起其它细胞的基因沉默。,RNAi的可遗传性 初期的试验观察到，细胞增殖50100倍仍可保持RNAi效应。这说明RNAi有放大的效应，或者有高效的催化机制。然而虽然RNAi的效应是长效的，甚至在注射的华丽线虫的子一代的整个生活周期里都能持续，但是由于它不能产生DNA的修饰，随着细胞的不断分裂，dsRNA被逐渐稀释，最终不能持续的遗传下去。,RNAi的应用,Large scale analysis gene functionDissect signal transduction pathwayDevelopment related geneGene therapy(virus infection,tumor),生命是自我复制的体系,三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体 功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA 可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。由RNA催化产生了蛋白质,DNA代替了RNA的遗传信息功能,DNA双链比RNA单链稳定；DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶，使之易于修复。,蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能,蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化反应，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演化成今天的细胞。,原核生物与真核生物核糖体成分的比较,E.coli核糖体小亚单位中rRNA与r蛋白的相互关系示意图线条表示相互作用及作用力的强（粗线）与弱（细线）（引自Alberts et al，1989）,E.coli（a）核糖体小亚单位中的部分r蛋白与rRNA的结合位点）（b）及其在小亚单位上的部位（引自Albert et al.，1989，图a;Lewin,1997,图b）,核糖体小亚单位rRNA的二级结构(a)E.coli 16S rRNA；（红色为高度保守区）(b)酵母菌18S rRNA，它们都具有类似的40个臂环结构(图中140)，其长度和位置往往非常保守；P、E分别代表仅在原核或真核细胞中存在的rRNA的二级结构。(Darnell et al.，1990),L11-rRNA复合物的三维结构(引自Porse et.al.,1999),
