《酶切连接与转化》PPT课件.ppt

限制性酶切、连接与转化,一、酶切1、核酸酶的分类：核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。,？如果内切酶可以切掉入侵的病毒DNA，为什么它们不会破坏宿主细胞自身的DNA,限制修饰系统 简称 R/M系统 restriction modification,类似于免疫体系，他能够识别自己的DNA和外来的DNA，并使外来的DNA降解。由两种酶来控制：修饰的甲基转移酶和核酸限制性内切酶。当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细胞时，相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体内的很多核酸也同样含有这样的序列，这时特异的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分核酸还没被限制以前就被甲基化了，这种甲基化核酸序列是限制性酶无法作用的。,2、限制性酶切的原理：限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。,3、限制性核酸内切酶的类型和主要特征：,限制性酶切序列,5 突出末端,3 突出末端,+,平末端,粘性末端,粘性末端:DNA片段经限制性内切酶切割后,在切割位点处所产生突出的5-或3-单链末端.,识别序列,限制性内切酶的特点,识别 4-8 bp 的回文序列.常用的酶识别 6 bp 发生的概率为 46=4096 bp/每次.(44=256 bp;48=65536 bp),高度特异性商业化生产反应需要Mg2+不同的内切酶可能产生相同的末端,5 GAATTC 33 CTTAAG 5,如 EcoRI 识别序列:,4.影响核酸限制性内切酶活性的因素,（1）DNA 纯度（2）DNA甲基化的程度（3）酶切消化反应温度（4）DNA的分子结构（5）限制性内切酶的缓冲液,5、限制性内切酶的星号活性,类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称的二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶右上角角一个星号表示，因此第二活性又称星号活性。概括起来，诱导星号的因素有以下几种：1,高甘油含量(5%,v/v);2,限制性内切酶用量过高(100u/ug DNA)；3,低离子强度(25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有机溶剂，如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）,二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接,DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。,常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶 来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。,T4连接酶作用分三步：T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶AMP复合物。(2)酶AMP复合物结合到具有5磷酸基和3羟基切口的 DNA上，使DNA腺苷化。(3)产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.,T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。,影响连接效率的因素：A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值（载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）为1：31：10）E 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。,三、转化,感受态细胞(Competent cells):经过 CaCl溶液处理的E.coli 细胞对外源DNA的吸收变得非常敏感，其细胞内的酶限制-修饰系统被抑制，有利于外源基因的转化、表达和繁殖，这种细胞被称作感受态细胞.转化(Transformation):感受态细胞吸收外源DNA的过程.热激(Heat-shock):将 DNA 与宿主细胞混合后，将宿主细胞放入42C 的温水中保温 1.5 分钟以增加转化效率的过程.,DNA 克隆的简单流程,基因组DNA,PCR产物,cDNA(插入子),质粒DNA(载体),限制性酶切(修饰 DNA 末端),连接载体与插入片段,转化(将重组质粒导入宿主细胞),分析重组子,谢谢,