Biochemistry B(8.2)核酸的结构.ppt

,请做好,上课准备,Chapter 9 核酸的结构,Nucleic Acid,一、核酸的发展简史（一）核酸的发现（二）著名的肺炎球菌转化试验（三）噬菌体转化试验（四）核酸的早期研究和DNA双螺旋结构模型的建立二、核酸的种类和分布（一）核酸的分类（二）核酸的分布三、核酸的功能（一）DNA的生物学功能（二）RNA的生物学功能四、核酸的组成（一）核酸的元素组成（二）核酸的基本结构单位核苷酸（三）多聚核苷酸,五、核酸的结构（重点、难点）（一）DNA的一级结构（二）DNA的二级结构（三）DNA的三级结构（四）RNA的结构六、核酸的水解（一）核酸的酸水解（二）核酸的碱水解（三）核酸的酶水解七、核酸的理化性质（一）核酸的一般物理性质（二）核酸的沉降特性（三）核酸的紫外吸收（重点）八、核酸的变性、复性和分子杂交（重点）（一）核酸的变性（二）核酸的复性（三）核酸的杂交,四、核酸的组成,（一）核酸的元素组成（二）核酸的基本结构单位核苷（三）多聚核苷酸,（一）核酸的元素组成,平均含磷量：DNA 9.9%RNA 9.4%,（二）核酸的基本结构单位核苷酸,核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。核苷酸本身由核苷和磷酸组成,而核苷则由戊糖和碱基形成DNA与RNA结构相似，组成成份略有不同。,DNA的结构,（二）核酸的基本结构单位核苷酸,1、组成核酸的碱基2、戊糖(pentose)3、核苷 nucleoside4、核苷酸 nucleotide5、修饰成分6、核苷酸的衍生物,核 酸,核苷酸,磷 酸,核 苷,戊 糖,含氮碱,1、组成核酸的碱基,腺嘌呤 adenine鸟嘌呤 guanine胞嘧啶 cytosine尿嘧啶 uracil胸腺嘧啶 thymine,（1）组成核酸的碱基嘌呤,嘌呤,腺嘌呤 adenine,鸟嘌呤 guanine,（2）组成核酸的碱基嘧啶,嘧啶,胞嘧啶 cytosine,尿嘧啶 uracil,嘧啶,胸腺嘧啶 thymine,嘧啶,RNA：D-核糖，A、G、C、U碱基DNA：D-2-脱氧核糖，A、G、C、T碱基,组成核酸的碱基的结构特征,碱基都具有芳香环的结构特征。嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。碱基的芳香环与环外基团可发生酮式-烯醇式或胺式-亚胺式互变异构。嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含共轭双键体系，紫外区有吸收（260 nm左右）,2、戊糖(pentose),3、核苷 nucleoside,糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。,4、核苷酸 nucleotide,核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5-磷酸-脱氧核糖核苷和5-磷酸-核糖核苷。,3 种腺苷酸的结构式,5,3,2,2 种脱氧腺苷酸的结构式,5,3,嘧啶碱：C1 N1，嘌呤碱：C1 N9。核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型碱基平面与核糖平面互相垂直,DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：AMP、GMP、CMP、UMP,5、修饰成分,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基种类很多，多是碱基甲基化的产物。,6、核苷酸的衍生物,ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)GTP(鸟嘌呤核糖核苷三磷酸)cAMP(3,5-环腺嘌呤核苷一磷酸)cGMP(3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸),（1）ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸),ATP 最显著特点：含两个高能磷酸键，水解可释放大量自由能。ATP 是生物体内最重要能量转换中间体。其水解释放出来能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。,（2）GTP(鸟嘌呤核糖核苷三磷酸),GTP是生物体内游离存在的另一种重要的核苷酸衍生物。它具有ATP 类似的结构,也是一种高能化合物。GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下,ATP 和 GTP 可以相互转换。,ATP GTP,（3）cAMP 和 cGMP,cAMP(3,5-环腺嘌呤核苷一磷酸)和 cGMP(3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作为细胞之间传递信息的信使。cAMP 和 cGMP 的环状磷酯键是一个高能键。在 pH 7.4 条件下,cAMP 和 cGMP 的水解能约为43.9 kj/mol，比 ATP 水解能高得多。,cAMP(3,5-环腺嘌呤核苷一磷酸)cGMP(3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸),细胞内的游离核苷酸及其衍生物,核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。环核苷酸3,5-cAMP，3,5-cGMP信号分子，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpp pppGpp ppApp核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。,（三）多聚核苷酸,多聚核苷酸是通过核苷酸的5-磷酸基与另一分子核苷酸的C3-OH形成磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为DNA链；由核糖核苷酸聚合而成的则称为RNA链。,5,3,脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA)原核：裸露的DNA分子集中于核区真核：细胞核DNA：与组蛋白、非组蛋白形成染色体 细胞器DNA：双链环形，一般裸露,多聚核苷酸的特点,两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键称为3,5-磷酸二酯键。其一端C5带有一个自由磷酸基，称为5-磷酸端（常用5-P表示）；另一端C3带有自由的羟基，称为3-羟基端（常用3-OH表示）。多聚核苷酸链具有方向性，表示时，必须注明它的方向是53或是35。,在多聚核苷酸（DNA或RNA）链中，构成核苷酸单元的戊糖和磷酸基是相同的，体现核苷酸差别的实际上只是它所带的碱基，所以多聚核苷酸链结构也可表示为：,多聚核苷酸的特点,A DNA的一级结构B 线条式表示法C 文字表示法,方向性,在讨论有关核酸问题时，一般只关心其中碱基的种类和顺序，所以上式可以进一步简化为：5PAPCPGPCPTPGPTPA 3 或5 ACGCTGTA 3,五、核酸的结构,（一）核酸的一级结构（二）DNA的二级结构（三）DNA的三级结构（四）RNA的结构,核酸的结构,一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。,由四种不同的核苷酸单元按特定顺序组合而成的线性结构聚合物，具有一定的核苷酸顺序，即碱基顺序。核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。,DNA的一级结构：5-AGTCCATG-3 AGTCCATG 3-TCAGGTAC-5RNA的一级结构：5-AGUCCAUG-3 AGUCCAUG,（一）核酸的一级结构,DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。而mRNA(信息RNA)的碱基顺序，则直接为蛋白质的氨基酸编码，并决定蛋白质的氨基酸顺序。,（一）核酸的一级结构,1953年，Watson和Crick在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,（二）DNA的二级结构,1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。,a.所有生物的DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。b.DNA的碱基组成具有种的特异性。c.DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。,Chargaff 规律 1950年,（二）DNA的二级结构,1DNA双螺旋结构的特点2DNA双螺旋结构的稳定性,DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析,Franklin,Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA),两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持每圈螺旋含10个核苷酸，碱基堆积距离0.34nm，双螺旋平均直径2nm大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nm,1DNA双螺旋结构的特点,（1）由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。,螺旋中的两条链方向相反一条链的方向为53另一条链的方向为35,两条反向平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35,（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧；碱基环平面与螺旋轴垂直。磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧;糖基环平面与碱基环平面成90角。,1DNA双螺旋结构的特点,磷酸与脱氧核糖彼此通过3,5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。,磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋内侧。,1DNA双螺旋结构的特点,（3）螺旋横截面直径约为2 nm每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4 nm。,每圈螺旋10.4 nt，碱基堆积距0.34nm，双螺旋平均直径2nm大沟：宽1.2nm，深0.85nm小沟：宽0.6nm，深0.75nm,（4）两条DNA链相互结合以及形成双螺旋的力是链间的碱基对形成的氢键。碱基的相互结合具有严格的配对规律，即A-T结合，G-C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,1DNA双螺旋结构的特点,碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行,两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起,螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持,2DNA双螺旋结构的稳定性,DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键；疏水作用力：双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力、范德华引力等。改变介质条件和环境温度，影响双螺旋的稳定性。,碱基堆积力形成疏水环境（主要因素）。碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。,稳定双螺旋结构的因素,其他类型DNA双螺旋,A-DNA：右手螺旋B-DNA：右手螺旋Z-DNA：左手螺旋,环状DNA的三种典型构象,（1）松弛环形DNA 线形DNA直接环化（2）解链环形DNA 线形DNA拧松后再环化（3）正超螺旋与负超螺旋DNA,（三）DNA的三级结构,超螺旋结构正超螺旋：过旋，上劲负超螺旋：欠旋，卸劲,正超螺旋：过旋，上劲负超螺旋：欠旋，卸劲,正超螺旋：过旋，上劲负超螺旋：欠旋，卸劲,DNA的存在形式,绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋结构（cccDNA）。,DNA的存在形式,组蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4核小体核心颗粒：2(H2A,H2B,H3,H4)+146bp DNA,H1,H1,衔接DNA:54bp DNA H1(与DNA和核小体核心颗粒均相连),核小体、染色质与染色体,（四）RNA的结构,1、RNA的种类、分布与功能2、RNA的二级结构,唐人街DNA灯,RNA的种类、分布与功能,2、RNA的二级结构,RNA是单链分子不遵守碱基种类的数量比例关系嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基总数RNA分子的双螺旋部分区域能形成双螺旋结构不能形成双螺旋的部分，则形成突环这种结构形象地称为“发夹型”结构,2、RNA的二级结构,RNA的双螺旋结构，碱基的配对情况不严格G 与C 配对G与U 配对，G-U 配对形成的氢键较弱tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分。,G CG U,稀有碱基,tRNA在甲基转移酶催化下，嘌呤生成 甲基嘌呤。如，AmA，GmA。尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸()。,稀有碱基,1、mRNA的结构与功能,mRNA可形成局部双螺旋结构的二级结构。mRNA在真核生物中的初级产物称为hnRNA。,内含子(intron)编码序列,外显子(exon)编码序列,加工,（1）原核生物mRNA结构特点,mRNA结构简单，多含几个功能上相关的蛋白质的编码序列，可翻译出几种蛋白质，为多顺反子。mRNA转录后一般不需加工，直接进行蛋白质翻译。转录和翻译发生在同一细胞空间，且几乎是同时进行。mRNA编码序列之间有间隔序列，可能与核糖体的识别和结合有关。在5端与3端有与翻译起始和终止有关的非编码序列。mRNA中没有修饰碱基，5端没有帽子结构，3端没有polyA尾巴。mRNA的半衰期比真核生物的要短，一般认为，转录后1min，mRNA就开始降解。,（2）真核生物mRNA结构特点,mRNA为单顺反子结构，即一个mRNA分子只包含一条多肽链的信息。成熟mRNA是由其前体核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）剪接并经修饰后才能进入细胞质中参与蛋白质合成。mRNA的合成和表达发生在不同的空间和时间。成熟的mRNA中5端有m7GpppN的帽子结构，与翻译起始有关；3端有polyA尾巴与mRNA的稳定性有关。mRNA半衰期通常较短。,（2）真核生物mRNA结构特点,mRNA为单顺反子结构，即一个mRNA分子只包含一条多肽链的信息。成熟mRNA是由其前体核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）剪接并经修饰后才能进入细胞质中参与蛋白质合成。mRNA的合成和表达发生在不同的空间和时间。成熟的mRNA中5端有m7GpppN的帽子结构，帽子结构可保护mRNA不被核酸外切酶水解，与帽结合蛋白结合识别核糖体并与之结合，与翻译起始有关。3端有polyA尾巴，长度为20250个腺苷酸，功能可能与mRNA的稳定性有关，少数成熟mRNA没有polyA尾巴，如组蛋白mRNA。mRNA半衰期通常较短。,大多数真核生物的成熟的mRNA分子具有（1）5-端7-甲基鸟苷三磷酸（m7GTP）帽子结构（2）3-端多聚腺苷酸(polyA)尾巴结构,1、mRNA的结构与功能,鸟嘌呤 guanine,m7GTP,7,5-P,3-OH,5,1,m7GTP,mRNA的5末端有一个7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸（m7Gppp）的“帽”式结构m7Gppp结构作用促进核糖体与mRNA的结合，与翻译起始有关加速翻译起始速度增强mRNA的稳定性，防止mRNA从头水解（核酸外切酶）,（1）真核生物mRNA 5-端帽子结构,真核生物mRNA 5-端帽子结构,6,（2）真核生物mRNA 3-端的polyA结构,3末端一段含30-200个核苷酸残基组成的多聚腺苷酸（polyadenylate tail，polyA尾巴）polyA并非DNA直接转录而来，而是转录后逐个添加polyA也称为mRNA的“靴”原核生物一般无polyA的结构与mRNA由胞核转位胞质及维持mRNA结构稳定有关，其长度决定mRNA半衰期少数成熟mRNA没有polyA尾巴，如组蛋白mRNA,tRNA的二级结构呈”三叶草”形状。结构上共同之处，一般可将其分为四臂四环：包括氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、TC区和可变区。除了氨基酸接受区外，其余每个区均含有一个突环和一个臂。,2、tRNA的二级结构,单链分子，但其某些局部也可形成双螺旋结构。含7393核苷酸，分子质量24 00031 000，沉降系数4S。分子最小，含稀有碱基最多，稀有碱基的含量可多达10-20%。如二氢尿嘧啶（DHU）、核糖胸腺嘧啶（rT）和假尿苷（）以及不少碱基被甲基化.3端为CCA-OH，5端多为pG分子中大约30%的碱基是不变的或半不变的，tRNA是保守性最强的RNA。,2、tRNA的二级结构,配对碱基形成局部双螺旋而构成臂不配对的单链部分则形成环,氨基酸接受区反密码区二氢尿嘧啶区TC区可变区,四臂四环,氨基酸臂由7对碱基组成，双螺旋区的3末端为一个4个碱基的单链区-NCCA-OH 3，腺苷酸残基的羟基可与氨基酸羧基结合起携带氨基酸的作用。,(1)氨基酸接受区,tRNA-CCA-OHHOOC-aa,反密码臂由5对碱基组成反密码环由7个碱基组成，大小相对恒定3个核苷酸组成反密码子（anticodon），在蛋白质生物合成时，可与mRNA上相应的密码子配对,(2)反密码区,二氢尿嘧啶环以含有2个稀有碱基二氢尿嘧啶（DHU）而得名大小不恒定，在8-14个碱基之间变动二氢尿嘧啶臂一般由34对碱基组成,3)二氢尿嘧啶区,TC臂由5对碱基组成假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由7个核苷酸组成，大小相对恒定几乎所有的tRNA在此环中都含TC序列,(4)TC区,可变环，又称为额外环位于反密码区与TC区之间不同tRNA分子中变化较大,可在421个碱基之间变动额外环大小是tRNA分类的重要指标,(5)可变区,DHU臂,辨认并结合氨基酰tRNA合成酶,氨基酸臂,携带氨基酸,反密码臂,识别mRNA上的密码,可变臂,TC臂,识别并结合核蛋白体,tRNA二级结构,3、tRNA的三级结构,20世纪70年代初，X线射衍技术发现 tRNA的三级结构为倒L形tRNA三级结构的特点氨基酸臂与TC臂构成L的一横，-CCA-OH3末端就在这一横的端点上，是结合氨基酸的部位二氢尿嘧啶臂与反密码臂及反密码环共同构成L的一竖，反密码环在一竖的端点上，能与mRNA上对应的密码子识别二氢尿嘧啶环与TC环在L的拐角上形成三级结构的很多氢键与tRNA中不变的核苷酸密切有关，促使各种tRNA三级结构都呈倒L形的在tRNA中碱基堆积力是稳定tRNA构型的主要因素,3、tRNA的三级结构,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的 三级结构均 为倒L型。,rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。rRNA与蛋白质一起构成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,4、rRNA的结构与功能,原核生物，rRNA有三种：5S，16S，23S16S rRNA+21种蛋白质核蛋白体的30 S小亚基5S 和23S 2种rRNA+34种蛋白质 核蛋白体50 S大亚基30S小亚基+50S大亚基原核生物70 S核糖体例如，大肠杆菌的三种rRNA分别由120(5S)、1542(16 S)和2904(23S)个核苷酸组成。,4、rRNA的结构与功能,大肠杆菌16S rRNA的二级结构,真核生物，rRNA有四种：5S，5.8S，18S，28S18S rRNA+33种蛋白质核蛋白体的40 S小亚基28S、5.8S和5S 种rRNA+49种蛋白质 核蛋白体的60 S大亚基40S小亚基+60S大亚基真核生物80 S核糖体例如，小鼠含121(5S)、158(5.8S)、1874(18S)和4718(28S)个核苷酸。,4、rRNA的结构与功能,小 结,一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。,（1）重复序列正向重复(direct repeat)反向重复(回文序列)(inverted repeat，palindrome sequence)具有对称结构的DNA片段，即双链DNA中似发夹的结构，每条链从3或5方向阅读时其核苷酸序列均相同特点：碱基序列的互补链之间正读反读都相同（并非在同一条链上正读反读）。例如，5GGTACC3 3CCATGG5,DNA一级结构的不均一性,了解,斗鸡山上山鸡斗 龙隐岩中岩隐龙雾锁山头山锁雾 天连水尾水连天,斗鸡山上山鸡斗 龙隐岩中岩隐龙雾锁山头山锁雾 天连水尾水连天,（1）重复序列回文结构序列是一种旋转对称结构，在轴的两侧序列相同而反向。两个反向重复序列不一定是连续的。较长的回文结构，形成茎环结构(发夹)或十字形结构，有助于DNA与特异性DNA结合蛋白结合。较短的回文序列，作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。转录的终止作用与回文结构有关。,DNA一级结构的不均一性,了解,较长的回文结构，形成茎环结构(发夹结构)或十字形结构,反向重复（回文序列）,反向重复（回文序列）,较长的回文结构，形成茎环结构(发夹结构)或十字形结构,较短的回文序列，作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。,限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例：,三股螺旋的DNA,（1）分子内的DNA三螺旋结构在一条自身回折的寡嘧啶核苷酸与嘌呤核苷酸双螺旋的大沟内结合第三股寡核苷酸。第三股链的碱基与原来双螺旋Watson-Crich碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对，即PyPu*Py、Py*Pu和Py*Pu等。“”表示Watson-Crich配对“*”表示Hoogsteen配对，第三股链与寡嘌呤核苷酸之间为同相平行绞链DNA是一种分子内折叠形成的三股螺旋。当DNA的一段多聚嘧啶核苷酸或多聚嘌呤核苷酸序列形成镜像重复时，即可回折产生H-DNA，又称H回文结构。在pH为酸性或负超螺旋张力的环境下，即发生B-DNA向H-DNA转变。,了解,三股螺旋的DNA,（2）分子间的DNA三螺旋结构在一定条件下，单链的脱氧核苷酸能够插入DNA双螺旋结构大沟的特定区域，通过氢键形成局部的分子间DNA三螺旋结构。（3）平行的DNA三螺旋结构平行的DNA三螺旋结构是指三螺旋结构中的第三条链的序列与DNA第一条链的序列相同，方向也相同。这种结构与基因的重组有关，故称R-DNA。,由5往3读和对侧序列从3往5读几乎完全相同,镜象重复（mirror repeat)某些情况下可以三股螺旋DNA,高度重复序列（high repetive sequence,satelite DNA，SSR)2-10bp/copy105-106 copies/genome多为串联重复排列（tandem repeats)分布于着丝点、端粒区、结构基因两侧中度重复序列（middle repetitive sequence)0.1-1Kb/copy10-104 copies/genome多为间隔重复rDNAtDNAHistone gene cluster低拷贝重复：基因家族单拷贝序列（single copy sequence),（2）富含AT的序列,很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对。,六、核酸的水解,（一）核酸的酸水解（二）核酸的碱水解（三）核酸的酶水解,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。,核酸的酸水解或碱水解,在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2或3磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。DNA一般对碱稳定，RNA对碱不稳定。,举例：,（一）核酸的酸水解对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键 嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键脱嘌呤：pH1.6，37，对水透析 pH2.8，100，1h脱嘧啶：98-100%甲酸，175，2h 三氟乙酸，155，60min（DNA）或80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的碱基组成,在强酸和高温，核酸完全水解为碱基，核糖或脱氧核糖和磷酸。在浓度略稀的的无机酸中，最易水解的化学键被选择性的断裂，一般为连接嘌呤和核糖的糖苷键，从而产生脱嘌呤核酸。,（二）核酸的碱水解RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.31mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2-或3-核苷酸的混合物。DNA抗碱水解生理意义：DNA更稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,DNA:当pH值超出生理范围（pH78）时，对DNA结构将产生更为微妙的影响。碱效应使剪辑的互变异构态发生变化。这种变化影响到特定碱基间的氢键作用，结果导致DNA双链的解离，称为DNA的变性RNA：pH较高时，同样的变性发生在RNA的螺旋区域中，但通常被RNA的碱性水解所掩盖。这是因为RNA存在的2-OH参与到对磷酸脂键中磷酸分子的分子内攻击，从而导致RNA的断裂。,生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸特异的磷酸二酯酶：核酸酶,（三）核酸的酶水解,1、核酸酶的分类,底物专一性：核糖核酸酶 RNase/脱氧核糖核酸酶 DNase作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶(endonuclease)单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶磷酸二酯键的断裂方式：5-（寡）核苷酸/3-（寡）核苷酸,2、RNAase,RNase H作用于DNA-RNA中的RNA链牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease),RNase I最适pH：7.0-8.2产物：以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶RNase T1耐热、耐酸产物：以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高RNase T2产物：以3-腺苷酸结尾的寡核苷酸,3、DNase,核酸酶S1作用于单链DNA部分牛胰核糖核酸酶，DNase I切断双链或单链DNA产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸DNA限制性内切酶,4、N-糖苷酶,核酸外切酶作用方式:从多聚核苷酸链的一端（3端或5端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶作用方式:和外切酶相反，从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。,根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶,限制性核酸内切酶,分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。,1、牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI)：从5磷酸末端切下寡聚核苷酸。2、牛脾脱氧核糖核酸酶(DNaseII)：从3磷酸末端切下寡聚核苷酸。3、限制性内切酶：存在于细菌体内，用于专一性地降解外源的DNA，限制性内切酶已成为基因工程最重要的工具酶。如 EcoRI,脱氧核糖核酸酶类,七、核酸的理化性质,（一）核酸的一般物理性质（二）核酸的沉降特性（三）核酸的紫外吸收,（一）核酸的物理性质,1、分子量在数百至数百万之间；2、微溶于水，不溶于有机溶剂；3、变性时粘度降低；2、核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离。在一定的条件下可形成兼性离子，为两性电解质，具有等电点。,（二）核酸的沉降特性,超速离心法纯化核酸。分离DNA常用氯化铯密度梯度；分离RNA常用蔗糖密度梯度；应用啡啶嗅红-氯化铯密度梯度平衡超离心可将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开，是实验室最常用的纯化质粒DNA的方法。请看515页,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，最大吸收峰波长（max）在260nm处，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,（三）核酸的紫外吸收,碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290 nm的紫外波段有强烈的光吸收，max=260nm,摩尔磷消光系数,增色效应：核酸发生变性时，摩尔磷消光系数 增加的现象。减色效应：复性后，摩尔磷消光系数 又降低的效应。,1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、含量计算1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判断DNA是否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）,八、核酸的变性、复性及分子杂交,(一)核酸的变性(denaturation)(二)核酸的复性(renaturation)(三)核酸的杂交(hybridization),核酸的变性:维系核酸三维结构的碱基堆积力和氢键受到某些理化因素的破坏，其三维结构改变，引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称为核酸的变性。,(一)核酸的变性(denaturation),变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸变性不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,(一)核酸的变性(denaturation),变性与降解的区别：,是否涉及共价键的断裂和分子量的改变。,核酸变性的特征,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。通常将引起DNA变性的温度称为融点，用Tm表示，指有一半双链DNA变成单链DNA的温度。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)2.44,影响DNA Tm大小的因素：,DNA均一性；G-C含量与Tm值成正比；介质中离子强度。,DNA均一性,均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。,浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在8295之间,Tm,浓度50 ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在8295之间,测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44,G-C含量与Tm值成正比,离子强度高，Tm高。,介质中离子强度,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高,粘度降低等。,核酸的复性:变性DNA在适当的条件下（一般低于Tm 20-25），两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。,(二)核酸的复性(renaturation),DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。,复性机制：10-20bp成拉链热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量。Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒表示。,P352 图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。,1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0m mol/L，则50%复性时，Cot1/2=410-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，Cot=10-4，t=0.1秒E.coli 4.2106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则复性50%，Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5108秒，5758天。,根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数,(二)核酸的复性(renaturation),热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,(三)核酸的杂交(hybridization),(三)核酸的杂交,核酸杂交,Southern blotting（Southern印迹法）：DNA-DNA杂交Northern blotting（Northern印迹法）：DNA-RNA杂交Western blotting（Western印迹法）：抗原-抗体结合,Southern Blotting,DNA样品 酶切 电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影变性（NaOH 0.5mol/L）转膜（NC膜，尼龙膜）固定（80，4-6h）杂交（高盐浓度，68，几小时）Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。,Northern Blotting,研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）,Western Blotting,抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。,六、核酸的凝胶电泳,1、琼脂糖凝胶电泳：分析分子量大于1000bp的DNA片段,2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：分析分子量小于1000bp的DNA片段,七、DNA的固相合成 520页,八、DNA的限制酶图谱,限制性内切酶,来源于细菌，高度专一地识别外源DNA上的特定位点，并将其切断，形成形成粘性末端或平齐末端。不降解自身细胞的DNA。因为在自身相应位点上经甲基化修饰而受到保护。,DNA的限制性内切酶图谱,何叫回文结构？,ATCGATCGATCGATTAGCTAGCTAGCTA,即对某DNA上所有的限制性酶切位点的确定。,本节完,