课题土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用：,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成 之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因：,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成。,氨,脲酶,3、反应式：,加入酚红指示剂？,一.研究思路,筛选菌株,统计菌落数目,设置对照,1、实例：,Taq酶是什么？如何筛选出来的？对筛选菌株有什么启示？,筛选菌株,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 其他微生物生长。,什么是选择培养基？,目的菌株,抑制或阻止,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,此培养基选择分解尿素的微生物的原理,怎样证明此培养基具有选择性呢？,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。,缺点：,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的培养皿中，经涂布培养，计算出菌落。统计的菌落数往往比活菌的实际数。,30300,平均数,低,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,设置对照：,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,（1）土样不同（2）培养基被杂菌污染（3）混入了其他的含氮物质,如何确定原因到底是什么？,二.实验的具体操作 土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要。制备培养基制备 的选择培养基。,灭菌,以尿素为唯一氮源,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,（三）样品的稀释,（四）取样涂布,（五）微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,五.课外延伸,测定饮水中大肠杆菌数量：将一定体积的饮水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现 色，可以根据此颜色的菌落数，计算出水样中的 数量。,伊红美蓝,黑,大肠杆菌,四、操作提示,三.结果分析与评价,