【教学课件】第六章水产动物病原的检测技术.ppt
第六章 水产动物病原的检测技术,第一节 免疫学检测第二节 PCR技术第三节 核酸分子杂交技术,第一节 免疫学检测,一、Ag-Ab反应的一般规律和特点二、Ag-Ab反应的影响因素三、免疫凝集试验四、免疫沉淀试验五、与补体相关的试验六、酶联免疫吸附试验七、荧光免疫技术,一、Ag-Ab反应的一般规律和特点,（一）特异性与交叉性（二）可逆性（三）Ag-Ab的结合比例与“带现象”（四）特异性结合与反应可见两个阶段,第一节 免疫学检测,（三）Ag-Ab的结合比例与“带现象”Ag-Ab结合需有适当比例-最适比，形成的结合物体积大、数量多，出现肉眼可见的反应。即Ag-Ab反应的等价带。若Ag 或Ab过多，比例不适，不能出现肉眼可见反应-“带现象”。Ab过剩-前带，Ag 过剩-后带。,第一节 免疫学检测,二、影响Ag-Ab反应的主要因素,1、电解质：生理盐水（0.85%NaCl）2、温度：37，水产动物2830 3、PH：68,第一节 免疫学检测,三、免疫凝集试验（凝集反应）,电解质颗粒性Ag+相应Ab 凝集小块（凝集原）（凝集素）反应种类 敏感度 直接凝集反应+间接凝集反应+间接凝集抑制试验+协同凝集试验+,第一节 免疫学检测,（一）直接凝集试验,第一节 免疫学检测,常用已知Ab测未知Ag。可用于细菌的鉴定、ABO血型分型,1、玻片法：定性,反应阳性,反应阴性,第一节 免疫学检测,2、试管法：定量（测定抗体的效价）,第一节 免疫学检测,（二）间接凝集试验可溶性Ag吸附在载体表面+Ab 凝集（致敏颗粒）可用来检测微量存在的Ab载体：红细胞-间接血凝试验 聚苯乙烯乳胶颗粒-间接凝胶凝集试验 硫酸铝、活性炭,第一节 免疫学检测,第一节 免疫学检测,（三）间接凝集抑制试验,可溶性Ag+相应Ab+相应致敏颗粒不出现致敏颗粒凝集可用来检测可溶性Ag如：免疫妊娠诊断试验：（1）诊断Ag：HCG致敏的乳胶颗粒（2）诊断血清：抗HCG的Ab（3）检测标本：尿液（是否含有HCG）,第一节 免疫学检测,（四）协同凝集试验,金黄色葡萄球菌细胞壁中的蛋白A（SPA）SPA+IgG暴露Fab片段+相应Ag协同凝集反应通常可用于检测可能存在的微量抗原 目前，已用于流脑、伤寒、布氏菌病的早期诊断,第一节 免疫学检测,四、免疫沉淀试验（沉淀反应）,可溶性抗原+抗体 肉眼可见的沉淀（沉淀原）（沉淀素）,第一节 免疫学检测,电解质,（一）环状沉淀试验,已知抗血清+待检抗原 液面交界处，白色环状沉淀主要用于抗原的定性试验，如细菌血清型鉴定等。,第一节 免疫学检测,数分钟,（二）琼脂扩散试验,可溶性Ag+相应Ab 白色沉淀线琼脂扩散：双向、单向琼脂扩散+电泳技术：对流电泳、火箭电泳、免疫电泳,第一节 免疫学检测,电解质、琼脂扩散,1、双向琼脂扩散,单个Ag-Ab系统 多个Ag-Ab系统,第一节 免疫学检测,制成凝胶板打孔加入Ag、Ab,特点：敏感性不高，所需时间较长。可用于：（1）定性检测可溶性Ag或Ab。（2）对复杂的Ag、Ab的提取纯度进行分析鉴定。,第一节 免疫学检测,2、单向琼脂扩散 将已知抗体与琼脂混匀 特点：操作繁琐,第一节 免疫学检测,3、对流电泳双向琼脂扩散+电泳技术试验在装有PH8.6缓冲液的电泳槽中进行。,第一节 免疫学检测,特点：操作简便，敏感性高，所需时间短。,4、火箭电泳 单向琼脂扩散+电泳 缓冲液PH8.6,第一节 免疫学检测,5、免疫电泳 先电泳，再双向琼脂扩散,第一节 免疫学检测,本试验样品用量小，特异性高，分辨力强，主要用于血清蛋白及抗体成分的分析研究,五、与补体相关的试验,（一）溶解试验1、溶血试验红细胞与相应抗体（溶血素）结合，通过激活补体使红细胞溶解2、溶菌试验 某些细菌与相应Ab结合，可激活补体，使细菌溶解（二）补体结合试验（CFT）是一种在补体参与的条件下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来测定有无相应抗原或抗体的血清学试验。,第一节 免疫学检测,待检系统,指示系统,第一节 免疫学检测,六、酶联免疫吸附试验（ELISA）Ag-Ab+酶底物显色用酶标测定仪分析优点：敏感性高，特异性强，可定性、定量。常用酶及底物：1、辣根过氧化物酶（HRP）底物：邻苯二胺（OPD）-黄色。四甲基联苯胺（TMB）-金黄色。2、碱性磷酸酶（AP）底物：对硝基苯磷酸盐（PNPP）-黄色。,第一节 免疫学检测,（一）直接法（二）间接法（三）双抗体夹心法（四）抗原竞争法,第一节 免疫学检测,特异性高；敏感性低,敏感性高；易非特异性吸附,适用于含两个以上表位的抗原,适用于小分子抗原,（一）直接法抗原（抗体）+酶标抗体（抗原）,第一节 免疫学检测,（二）间接法 用已知Ag检测未知Ab的效价。已知Ag吸附于载体 洗涤加被检血清，Ab与Ag结合 洗涤 加酶标二抗，使与Ag-Ab复合物结合。洗涤 加底物显色,第一节 免疫学检测,酶标板,第一节 免疫学检测,第一节 免疫学检测,（三）双抗体夹心法用已知Ab检测未知Ag。已知Ab吸附于载体 洗涤 加可能含Ag的待检溶液 洗涤 加酶标记Ab 洗涤 加底物,第一节 免疫学检测,（1）已知Ab吸附于载体（2）a、加酶标记Ag，b、加酶标记 Ag 和可能含Ag的待检溶液（3）（3）b-（3）a=待检溶液的Ag量。,（四）抗原竞争法：用已知Ab检测未知Ag（小分子抗原）,七、免疫荧光技术,又称荧光抗体技术。荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）-黄绿色荧光四乙基罗丹明（RB200）-橙色荧光四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）-橙红色荧光,第一节 免疫学检测,（一）直接法含未知Ag待检标本（固定在玻片上）+已知荧光Ab洗去游离的荧光Ab干燥后，荧光显微镜下观察。优点：方法简便、特异性高。缺点：敏感性偏低、如检测多种Ag需制备多种相应的 荧光抗体标记。,第一节 免疫学检测,第一节 免疫学检测,（二）间接法 待检样品（未知Ag）+Ab（已知）荧光标记抗Ab冲洗、干燥、荧光显微镜下观察。优点：敏感性高，制备一种荧光标记抗Ab即可对多种 Ag-Ab系统进行检测。缺点：易出现非特异性荧光。,第一节 免疫学检测,第一节 免疫学检测,免疫荧光抗体技术检测兔抗血清结果,a-SR1b-副溶血弧菌c-哈维氏弧菌d-爱德华氏菌e-荧光假单胞菌f-大肠杆菌（bar=20m）,一、定义多聚酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）：在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。,第二节 PCR技术,二、反应体系和过程1、PCR反应缓冲液 2、模板DNA3、引物4、Taq DNA聚合酶5、4种脱氧核糖核苷酸(4dNTP)一个循环包括：变性、退火、延伸一般20-30个循环。,第二节 PCR技术,1-16S rRNA2-HSP60,PCR扩增结果,第二节 PCR技术,以HSP60基因构建的弧菌系统发育树,1、名词解释：带现象、PCR2、抗原抗体反应的一般规律有哪些？3、酶联免疫吸附试验中常用哪几种酶和底物？,第六章 水产动物病原的检测技术（思考题）,
