【教学课件】第三章酶的发酵生产.ppt

第三章 酶的发酵生产,第一节 产酶微生物,酶工业生产的历史1酶发酵生产的细胞必需具备如下条件酶的产量高；产酶稳定性好；容易培养和管理；发酵周期短，营养需求简单；产物杂质少，利于酶的分离纯化(胞外酶）；安全可靠，非致病性（在系统发育上最好是与病原体无关）（FAD和WHO的JEFA）。,1）不同类型、植物、动物细胞的特性比较,0.22.0m,1.01.25 38 m,15X530m,210m（长）,20300 m（长）,10100 m,2）动植物细胞培养缺点,动植物细胞体积大、对剪切力敏感，要求特殊生物反应器。动物细胞培养方法：悬浮培养，依附培养（PHA），固定化细胞培养（固定化组织）。植物细胞培养方法：悬浮培养，摇瓶，通用式发酵罐（气升式、鼓泡式、旋转圆筒式），植物器官（甜菜糖苷，谢绍萍）。动植物细胞生长速率、代谢速率低，发酵周期长，对防止杂菌污染的技术要求高。动物细胞营养要求苛刻（血清）,2常见酶发酵生产用微生物,利用微生物产酶的优点Bacillus subtilis：-淀粉酶，中性蛋白酶Esherichia coli（胞内酶）：半乳糖苷酶，谷氨酸脱羧酶，天门冬酸酶，苄青霉素酰化酶，限制性核酸内切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶，核酸外切酶Aspergillus niger：糖化酶，果胶酶，纤维素酶，半纤维素酶，葡萄糖氧化酶，酸性蛋白酶，柚苷酶，Aspergillus oryzae：淀粉酶，中性蛋白酶，果胶酶，氨基酰化酶、脂肪酶，磷酸二酯酶Rhizopus：糖化酶，转化酶，脂肪酶，酸性蛋白酶，半纤维素酶,Mucor：蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，凝乳酶Penicillium（产黄青霉）：葡萄糖氧化酶，青霉素酰化酶，果胶酶，纤维素酶，桔青霉，5磷酸二酯酶，脂肪酶，葡萄糖氧化酶，核酶酶，凝乳蛋白酶，Trichoderma：纤维素酶，17-羟化酶Streptomyces：葡萄糖异构酶，中性蛋白酶，几丁质酶Saccharomyces cerevisiae：转化酶Candida：脂肪酶，转化酶，尿酶，乳糖酶脆壁酵母：乳糖酶,工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源,工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源,工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源,3、菌种分离,1）高产酶的菌种收集：土壤；发酵生产材料；菌种保藏中心。2）富集培养3）菌种纯化,第二节 酶生物合成调节的基本理论,酶的生物合成：酶在生物体内产生的过程。酶的发酵生产：通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要酶的过程。,酶合成转录水平上的调节,底物和代谢产物对基因活性的调节（负控诱导、负控阻遏）编码蛋白质和淀粉等分解酶的基因。合成各种细胞代谢过程中所必需的小分子物质（如氨基酸、嘌呤和嘧啶）的酶的基因。,弱化子对基因活性的调节（转录弱化作用）某些酶基因的起始密码前有一段一定长度的mRNA片断（前导区），此mRNA片断通过自我配对可形成茎环结构，特殊氨基酰tRNA的浓度影响了核糖体在mRNA上的位置，从而决定了mRNA的二级结构，达到微调基因转录的目的。该片断的缺失会提高酶的表达量。1）：trp高或低，表达水平相差600倍 2）：无阻遏物，trp有或无，表达水平相差8-10倍,mRNA二级结构,DNA转录与mRNA翻译,细菌的应急反应当氨基酸全面匮乏时，细菌产生应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。信号是鸟苷四磷酸和鸟苷五磷酸。诱导物是空载tRNA。当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的空载tRNA，激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，浓度增加10倍以上。ppGpp的出现关闭许多基因，打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。,乳糖操纵子模型,1960年，Jacob和Monod操纵子：结构基因、调节基因、启动子和操作子,诱导作用,定义：加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程。酶 基质 基质结构类似物-半乳糖苷酶 乳糖(+)异丙基巯基-D-半乳糖苷(+)安慰性诱导物,LacZ(-半乳糖苷酶)常作为指示基因（报告基因），在含IPTG(Isopropul-D-Thiogalactoside)和X-gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-D-Galactoside)的平板中，呈现蓝（5-溴-4氯靛蓝）白色菌落，进行阳性克隆子的筛选。,酶 基质 产物葡萄糖淀粉酶 淀粉(+)麦芽糖，异麦芽糖(+)；葡萄糖(-)脂肪酶 油脂(+)(-)脂肪酸(-)纤维素酶 纤维素(+)葡萄糖(-)什么意义,反馈阻遏作用,定义：酶催化作用的产物或代谢途径的未端产物使该酶的生物合成受阻的过程。限制曲霉培养基中磷酸盐浓度可增加核酸酶、磷酸酯酶、植酸酶的生产30到50倍。,色氨酸的过量积累，对色氨酸合成途径中的5种酶的生物合成均起反馈阻遏作用。E、D、C、B、A分别为邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸磷酸转移酶，邻氨基苯甲酸异构酶，吲哚甘油-3-磷酸合成酶，色氨酸合成酶。分枝酸 色氨酸,分解代谢物阻遏,定义：容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。葡萄糖阻遏半乳糖苷酶的生物合成机理：葡萄糖的大量存在，降低了胞内cAMP浓度（葡萄糖抑制腺苷酸环化酶活性，降低cAMP生成：ATPcAMP+Pii；或 葡萄糖存在引起ATP浓度上升，消耗胞内cAMP：cAMP+H2OADPATP），结果启动子上没有cAMPCRP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到启动子的位点上。,第三节 酶的发酵生产技术,一、微生物发酵产酶方式1.固体培养定义：利用麸皮、米糠等主要原料，添加谷壳等辅料，加水拌成半固体状态，供微生物生长和产酶用（酒曲）。浅盘法、转桶法、厚层通气法？,优点：设备简单，投资较少。环境污染少；特别适用于霉菌的培养和发酵产酶。缺点：劳动强度大；原料利用率低；产酶纯度较差；提取精制较难；传质传热效率低，发酵条件不易控制均匀，产酶不稳定；不宜胞内酶生产（菌体分离难度大）,2.液体深层发酵液体表面发酵，液体深层通风发酵优点：产酶纯度高，质量稳定；较易控制发酵条件，有利于自动化控制；机械化程度高，劳动强度小；设备利用率高。缺点：设备投资较大（价钱）。,3.固定化细胞发酵优点：固定化细胞的密度大，反应器生产强度大；发酵稳定性好，可以连续使用较长时间，易于连续化，自动化生产；可在高稀释率的条件下连续发酵（Dm）,提高设备利用率；发酵液含菌体较少，利于产品分离。缺点：不能强烈搅拌；技术要求高，传质传热效果差（氧气供给，温度控制。培养基成分的控制）；理论研究阶段；只适用于胞外酶的生产；,二、发酵工艺条件及控制,1酶的发酵生产要求性能优良菌种（产率，稳定性，发酵周期，营养要求，副产物，安全性）满足菌种生长需求；满足菌种产酶需求。2酶发酵生产的工艺流程保藏菌种菌种活化菌种扩大培养发酵分离纯化酶,三、培养基,培养基：人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。培养基设计考虑：菌种特性不同培养阶段产物原料来源难易。,1 碳源：角色：能量；细胞和各种代谢产物的碳架种类：淀粉及其水解物（主要），烷烃、甲醇对发酵的影响：营养对酶生物合成的代谢调节（诱导，反馈阻遏，分解代谢物阻遏）,2 氮源：角色：蛋白质（包括酶）和核酸的主要元素。种类：无机氮，有机氮氮源对发酵的影响：碳氮比（C/N）：培养基中碳元素（C）的总量与氮元素（N）的总量之比（PHA）。代谢调节氨基酸浓度NH4+,3 无机盐角色：提供生命活动不可缺少的无机元素（参与细胞的组成，细胞能量代谢，调节细胞膜的透性，酶的激活剂），并对培养基的pH，氧还电位，渗透压起调节作用。主要元素：磷、硫、钾、镁、钙、钠、钾微量元素：铁、铜、锌、锰、钴、铜、锰,cps gene is strongly enhanced under conditions optimized for gibberellin biosynthesis and is reduced when high amounts of ammonium are present in the medium（位置不对）.,4 生长因子定义：细胞生长繁殖不可缺少的微量有机化合物，如aa,Vit,嘌呤，嘧啶，激素提供生长素的天然原料：玉米浆，麦芽汁，酵母膏等。5 产酶促进剂定义：凡能显著增加酶产量的某种少量物质。主要为酶的诱导物或表面活性剂。表面活性剂：提高膜的诱性对酶的失活有保护作用消泡以提高氧传递系数,四、pH 值,1 与细胞的生物繁殖以及发酵产酶有密切关系。影响微生物体内各种酶的活性，从而导致微生物的代谢途径发生改变；影响微生物形态和细胞膜的透性，从而影响微生物对培养基中的营养成分的吸收和代谢产物的分泌。影响培养基中某些营养物质的分解或中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用，影响培养基的氧化还原条件。,2 生长繁殖最适pH（一般情况下）细菌、放线菌6.58.0 霉菌、酵母菌 4.06.0植物细胞 56产酶最适pH：酸性蛋白酶46，中性蛋白酶67，碱性蛋白酶8.59；一般接近该酶反应的最适pH3 发酵过程中培养基pH的变化由菌种的特性、培养基组分、发酵条件等决定，引起pH变化的主要原因：微生物对培养基营养成份的利用和代谢产物的积累。,生理酸性物质的生成或释放，或生理碱性物质的消耗导致发酵液pH下降。生理碱性物质的生成或释放，或生理酸性物质的消耗导致发酵液pH上升。4 pH控制初级调节控制（起始培养基）调整C/N，调整生理酸性物质与生理碱性物质之比。补料调节：流加酸/碱，流加碳、氮源溶解氧调节：控制代谢中间产物的氧化程度。,五、温度,1 最适生长温度：枯草杆菌3437，黑曲霉2832，植物细胞252 最适产酶温度低于最适生长温度，在较低温度下，提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。3 有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同温度条件。,例：用枯草芽胞杆菌AS1.3398生产中性蛋白酶 温度控制 发酵时间 发酵单位变温 0-4h 30-30 4-8h 32-40(2/h)26.5 7100u/ml 8-12h 40-32(2/h)12h后 30-32恒温 30-32 27h 4275u/ml,4 微生物代谢产生生物热，除了部分能量以ATP形式贮存在微生物体内生成菌体和产物，其余以热的形式散发。一般淀粉质原料好气发酵微生物产生的生物热为(30005000)4.187kJ/m3.h旺盛期产生生物热：70004.187kJ/m3.h.控制温度方式：夹套，盘管,六、溶解氧,1 细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要大量的能量2 调节溶氧速率的方法：调节通气量。调节氧的分压：富氧 增加空气压力。调节气液接触时间：增加液位高度，增设档板。调节气液接触面积：提高搅拌速率，空气分布管及其直径 培养液的特性：粘度、表面张力菌体浓度，离子浓度,七、泡沫和表面张力有关？,1 酶制剂发酵过程中产生的泡沫较多，产生原因：强烈的通气搅拌和培养基中天然蛋白质原料含量较高。2 造成危害：阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；溢罐，导致浪费原料，引起染菌；装液量减少，降低发酵罐的利用率。,3 采取措施：减少泡沫形成（原料，罐压大小？，搅拌）机械消泡与化学消泡。消泡剂：天然油脂；高碳醇脂肪酸和酯；聚醚；硅酮。,八、湿度,固体发酵法：控制培养基的湿度和发酵室空气中的相对湿度。,九、发酵过程的中间补料,补料方案：补糖(碳源)补氮源补无机盐和产酶促进剂补全料和补水。淀粉酶：用3倍浓度碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1/2；从培养12h开始，每小时1次，分 30余次添加完毕。糖化酶：补氨水，C、N源总浓度 30-35%酶活2500030000U/ml,第四节 酶发酵动力学,酶发酵动力学：研究发酵过程中速率及其影响因素的科学。包括细胞生长动力学、反应基质消耗动力学和酶生成动力学等。重点探讨酶生成动力学,1、同步合成型,酶的合成与生长同步进行。米曲霉可由单宁诱导生成单宁酶酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。这类酶所对应的mRNA很不稳定。dP/dt=dX/dtqP=,2、延续合成型,酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。这类酶所对应的mRNA相当稳定，在生长稳定期以后相当长的一段时间内继续用于酶的合成。dP/dt=dX/dtXqP=,3、中期合成型,酶合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，酶的合成也随着停止。酶的生物合成受到反馈阻遏，而且其所对应的mRNA不稳定。dP/dt=dX/dt qP=0 存在阻遏物 0 解除阻遏后,4、滞后合成型,只有当细胞生长进入稳定期后，酶开始合成并大量积累。酶的生物合成受分解代谢物阻遏作用，这类酶所对应的mRNA稳定性高。dP/dt=X qP=,总结,mRNA的稳定性，培养基中诱导物，反馈阻遏物，分解代谢物的存在是影响酶生物合成模型的主要因素。mRNA稳定性 代谢调节 产物生成模型同步合成型(-)诱导 dP/dt=dX/dt 延续合成型(+)诱导 dP/dt=dX/dtX中期合成型(-)反馈阻遏 dP/dt=dX/dt（解除阻遏后）滞后合成型(+)分解代谢物阻遏 dP/dt=X,理论的应用,目的：提高产酶率和缩短发酵周期最理想的合成模式：延续合成型策略措施：菌种选育：提高mRNA的稳定性，解除分解代谢物阻遏和反馈阻遏。发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳氮源的使用，补料发酵）。降低产酶温度。,P启动子包括两个结合位点：RNA聚合酶结合位点，cAMPCRP复合物结合位点,安慰性诱导物,能够发挥诱导作用的基质的结构类似物。例如异丙基巯基-D-半乳糖苷、巯甲基-D-半乳糖苷、邻硝基苯-D-半乳糖苷，是-半乳糖苷酶的安慰性诱导物。,回转式发酵制曲机,通风制曲池,如合成n个肽键的酶蛋白多肽链，就需要消耗(4n+3)个ATP的高能磷酸键 激活，起动，延长，终止，折叠和加工激活，延长，移位,笼式通气搅拌生物反应器,凝乳酶作用原理,