【教学课件】第一章核酸化学.ppt

基础生物化学 Basic Biochemistry,河南农业大学教学课件,制作：刘卫群 郭红祥 籍 越,策划：刘卫群,第一章 核酸化学,本章内容：核酸的分布和分类核酸的化学组成核酸的分子结构核酸的性质核酸的分离纯化核酸的定量测定,核酸,一、核酸的分布和分类,核酸的分布,DNA：细胞核（98%）、线粒体、叶绿体RNA：细胞质rRNA：核仁中合成，占总RNA的80%tRNA：核内合成，占总RNA的15%mRNA：核内合成，占总RNA的5%,核酸,二、核酸的化学组成,碱基,稀有碱基,戊糖,核苷与核苷酸,核苷：核苷酸,核苷,糖苷键,核苷酸,常见的核苷酸及其缩写符号,多磷酸核苷酸,常见核苷酸及缩写,特殊的核苷酸,3，5-环化腺苷酸,三、核酸的分子结构,DNA的分子结构,DNA的一级结构,DNA的二级结构,RNA的分子结构,DNA的三级结构,mRNA的结构,tRNA的结构,rRNA的结构,连键：3，5-磷酸二酯键方向：3-末端5-末端,核酸的一级结构,一级结构的线条式缩写,一级结构的文字式缩写,TGCAGGTTAAAGG它的互补链:ACGTCCAATTTCC(误)CCTTTAACCTGCA(正)3-ACGTCCAATTTCC-5(正),Chargaff规律,嘌呤与嘧啶的摩尔数相等：A=T；G=C；A+G=C+TDNA的碱基组成具有种的特异性DNA的碱基组成没有组织的特异性年龄、营养状态、环境的改变不影响DNA的碱基组成,DNA的空间结构,1953年Watson和Crick提出了著名的DNA双螺旋结构模型,DNA双螺旋结构模型的主要内容,由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕而成的右手双螺旋碱基处于螺旋内侧，而磷酸及戊糖位于外侧。碱基的平面与螺旋轴相垂直，糖平面与碱基平面几乎成直角,螺旋的直径为2nm相邻碱基在螺旋轴上间距为0.34nm，旋转夹角为3，每对核苷酸形成螺旋的一圈，螺距为.4nm。沿着走向，磷酸、戊糖骨架形成深浅不同的凹陷，即大槽和小槽。,两条链借碱基之间的氢键和碱基堆积牢固地连为一体。碱基配对严格按照互补原则即A与T配对，其间形成2个氢键，G与C配对其间形成3个氢键。,DNA螺旋结构演示,DNA双螺旋结构的类型,B-DNAA-DNAZ-DNA,DNA双螺旋结构的稳定性,碱基对间的氢键碱基堆积环境中的正离子,DNA的三级结构,定义：DNA的三级结构是指在二级结构的基础上DNA双螺旋的进一步卷曲。类型：开链环状、闭链环状、超螺旋结构,DNA超螺旋的形成,单击此处,RNA的分子结构,RNA分子结构的特点：多以单链形式存在；单链RNA分子局部回折，在某些区域形成短的双螺旋区；没有参与配对的区域形成突环；,信使RNA（mRNA）的结构,RNA分子结构特点：大多数真核细胞mRNA在3-末端有一段长约200个残基的多聚腺苷酸（Poly A）真核细胞mRNA的5-末端有一极为特殊的帽子结构，称为“帽子（Cap）”：m7GpppNm,AA.AA,200APoly A,3-端,5-端,帽子结构,编码区,转移RNA（tRNA）,tRNA二级结构特点：分子量较小；在碱基组成上，有较多的稀有碱基；tRNA的3-末端，皆为CCAOH；5末端多数为pG，也有pC.；tRNA的二级结构都呈三叶草形。三叶草结构由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TC环等五部分组成。,tRNA的三级结构,tRNA的三级结构呈倒L形,四、核酸的性质,核酸的一般性质核酸的紫外吸收性质核酸的变性、复性和分子杂交,核酸的一般性质,核酸及核苷酸都是两性电解质核酸不溶于一般的有机溶剂，但可溶于乙醇的水溶液核酸有较大的粘度,DNA的紫外吸收性质,最大吸收峰：260nm减色效应：大分子的DNA在260nm的消光值，比DNA分子中的各个碱基260nm处的消光值总各小得多，这种现象称减色效应。,核酸的变性、复性和分子杂交,变性：在一些理化因素的作用下，核酸中氢键断裂，双螺旋解开，变成无规则线团的现象增色效应：核酸变性时，在260nm的消光值显著增加的现象解链温度（Tm）：通常指增色效应达到最高值的一半时的温度,与DNA的Tm值有关的因素,DNA的均一性G-C含量：G-C%=（Tm-69.3）2.44介质中的离子强度,DNA的复性与分子杂交,复性：热变性的DNA，在缓慢冷却后，分开的双链又可恢复为双螺旋结构的过程。影响复性的因素：离子强度温度DNA的大小DNA的浓度,Southern凝胶转移杂交技术,五.核酸的分离纯化,1.分离纯化的一般原则,总的要求：去除蛋白质等各种杂质，保持核酸不发生变性或降解，最终得到完整而具有天然生物活性的核酸制品。,注意事项：（1）避免高温、强酸和强碱等变性因素，在低温（04度）和PH59的条件操作。（2）在制备DNA时要避免机械力的剪切作用，操作时动作轻缓，搅拌要温和，避免用细口滴管吸放DNA。（3）防止核酸酶的作用，特别在制备RNA时要防止RNA酶的降解作用。,2.分离纯化方法,DNA的分离纯化：（1）在破碎细胞的同时，用浓盐或SDS等使蛋白质与DNA解联。（2）蛋白酶K消化以使蛋白质部分裂解。（3）通过缓冲液饱和的苯酚抽提以除去蛋白。（4）通过RNAase消化使RNA降解。（5）通过透析除去小分子物质如核苷酸、氨基酸、小分子糖。（6）利用氯仿-异戊醇处理进一步除去蛋白。（7）70乙醇沉淀DNA.（8）Sepharose或Sephadex凝胶柱纯化。（9）琼脂糖凝胶电泳进一步分离和鉴定。（10）线粒体、叶绿体DNA的提取应先分离线粒体、叶绿体。,3.核酸的保存,将DNA溶解于PH8的10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA的TE缓冲液中，在4度以下可保存半年。,将DNA以沉淀的形式保存在75乙醇中，在-20度中可以长期保存。,RNA可以冻干成干粉的形式或在含2的醋酸钠的乙醇中低温保存。,六.核酸、核苷酸的颜色反应及其在分析测定上的应用,1.核酸和核苷酸中糖的颜色反应,核糖与苔黑酚反应(670nm):RNA+浓盐酸苔黑酚 蓝绿色物质（3,5-二羟甲苯）,100度,脱氧核糖与二苯胺反应(595nm)：DNA+冰醋酸和少量浓硫酸二苯胺 蓝色物质,100度,2.核酸和核苷酸的含磷量测定,DNA含P:9.2RNA含P：9.0,核酸的量为磷的量的11倍左右,先用浓硫酸将核酸、核苷酸消化，使有机磷转化为无机磷，然后用钼酸铵定磷试剂测定（660nm）。,本章重点掌握的内容,基本知识：基础性的框架知识核酸的结构：DNA、tRNA和mRNA核酸的性质,