《香味前体成分》PPT课件.ppt

烟草主要香味前体成分及其分析技术,王 昇郑州烟草研究院烟草化学重点实验室,烟草中主要香味前体成分,多酚类化合物色素类化合物类西柏烷化合物赖百当类化合物糖酯,烟 草 中 的 多 酚,丹宁类 绿原酸及其异构体黄酮类 芸香苷、坎菲醇-3-芸香糖苷 香豆素类 莨菪亭、莨菪灵,丹宁类 绿原酸及其异构体的结构,绿原酸 新绿原酸 4-o-咖啡奎尼酸,香豆素类,黄 酮 类,莨菪亭 莨菪灵,R=H R=d-葡萄糖基,R=CH3 R=CH3,芸香苷 坎菲醇-3-芸香糖苷,R=OH R=H,R=芸香苷基 R=l-鼠李糖苷-l-葡糖基,香豆素类,是顺邻羟基桂皮酸的内酯，基本骨架为苯并-吡喃酮，7-位常有羟基或醚基。,部分香豆素在生物体内以邻羟基桂皮酸苷的形式存在，酶解后苷元邻羟基桂皮酸立即内酯化而成香豆素。香豆素化合物常具有蓝紫色荧光。,1、名称由来：此类化合物多为黄色，且具有酮式羰基，故称黄酮类化合物。2、存在形式：黄酮类化合物广泛存在于植物中，不少的常用中药中主要含有此类成分。大多与糖结合成苷，称为黄酮苷类；有的以游离形式存在，即未与糖结合，称为游离黄酮或黄酮苷元，同一植物中可能同时存在游离黄酮及其苷。,黄酮类化合物,仅截止到1974年为止，国内外已发表的黄酮类化合物共1674个（主要是天然黄酮类，也有少部分为合成品，其中苷元902个，苷722个）以黄酮醇类最为常见，约占总数的三分之一，其次为黄酮类，占总数的四分之一以上，其余则较少见。至1993年，黄酮类化合物总数已达到4000个。,黄酮类化合物的结构,凡两个苯环（A环、B环）通过三碳链相互联结而成的一类成分称为黄酮类化合物。大多具有6C-3C-6C的基本骨架，且常有羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等取代基。,生物合成研究表明A环来自于三个丙二酰辅酶A，B环来自于桂皮酰辅酶A,黄酮类化合物的分类,根据B环连接位置（2位或3位）、C环氧化程度、C环是否成环等将黄酮类化合物分为以下几大类。黄酮和黄酮醇 二氢黄酮和二氢黄酮醇 异黄酮和二氢异黄酮 查耳酮和二氢查耳酮类 橙酮类 花色素和黄烷醇类 其他黄酮类,天然黄酮类化合物多和糖形成苷而存在，并且由于糖的种类、数量、连接位置及连接方式不同，组成了各种各样的黄酮苷类。单糖类：D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-葡萄糖醛酸等。,双糖类：槐糖（glc 12 glc）、龙胆二糖(glc 16 glc)、芸香糖(rh 16 glc)、新橙皮糖（rh 12 glc）、刺槐二糖（rh 16 gal）等。三糖类：龙胆三糖(glc 16 glc 12 fru)、槐三糖(glc 12 glc 12 glc)等。酰化糖类：2-乙酰葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖(caffeoylglucose)等。,多酚化合物对烟叶颜色的影响,一方面由于在多酚氧化酶的作用下,多酚氧化成醌类物质;另一方面多酚及其氧化物参与棕色化反应生成类黑素等物质。在烟叶烘烤和晾制期间形成棕色素的反应取决于绿原酸和芸香苷的氧化作用。多酚化合物的氧化不但在调制过程中进行,而且在贮存、发酵、陈化、加工等过程中仍然可继续缓慢地进行。烟叶的颜色还会不断的加深。,1960年Wright,H.E.,JR.等研究了白肋烟中的棕色素中不被透析的组分，测得其含有氮、硫、磷、铜、钙等元素；水解溶液中鉴定出了18种氨基酸；并确认棕色素中含有芸香苷和绿原酸；认为棕色素是离子-蛋白质-绿原酸-芸香苷的复合物。,1961年JAY S.JACOBSON通过对棕色素的水解等实验进一步证实棕色素可能是由多酚和蛋白质组成的。同年JACOBSON在烟叶上施用14C标记过的绿原酸和芸香苷，检测棕色素活性同样证实其含有绿原酸和芸香苷.,1967年等对烟气冷凝物和棕色素的碱熔产物比较研究，认为棕色素不仅含有离子、多酚和氨基酸，还含有生物碱和硅酮。1970年Weybrew,J.A.等研究的棕色素的主要组成是绿原酸和蛋白质。蛋白质部分可能就是PPO本身,烟草中的多酚主要以绿原酸、芸香苷和莨菪葶为主。多酚类化合物对烟叶品质的影响，主要有两个方面，即烟叶色泽和烟叶香气。多酚类化合物挥发性低，燃吸时很少直接转移到烟气中，而是分解后进入烟气，所以它们直接影响烟气香味，增加其香味复杂性。,多酚类化合物对烟叶品质的影响,一般认为多酚类物质对烟草吃味和香气有好的影响。多酚类在烟草燃烧时产生酸性反应,能中和部分碱性,使吃味醇和。多酚化合物不但本身具有令人愉快的香气,而且在燃吸时由于干馏、氧化、裂解的结果,产生各种各样芳香气味的成分。因此,多酚化合物被认为是产生烟草香气的主要成分之一。,多酚类物质亚硝酸盐清除剂,N2O3,亚硝酸盐,-CO2,H3O+,多酚的分析方法,测定绿原酸的方法有红外光谱法、薄层色谱法、分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法和化学发光分析法 测定芸香苷的方法有流动注射化学发光分析法、高效液相色谱化学发光、反相高效液相色谱法测定莨菪亭的方法有双波长薄层扫描法、反相高效液相色谱法、薄层刮板荧光分析法、高效液相色谱法,烤烟中多酚类化合物液相色谱图,不同等级卷烟的多酚化合物的含量,多酚化合物含量与烟叶等级相一致,高等级烟叶多酚含量高,低等级烟叶多酚含量低。,不同类型烟草中多酚含量比较,植物中的天然酚酸类化合物,天然酚酸类化合物在植物界中广泛分布,具有调节植物生长和代谢、抵御病害虫入侵等多方面功效,并大多具有确切的药理活性和药用价值。,天然酚酸类化合物的分类,苯甲酸为母核的酚酸类成分 桂皮酸为母核的酚酸类成分 苯乙酸为母核的酚酸类成分,天然酚酸类化合物的药理作用,抗氧化作用 抗病毒作用 抗肿瘤作用,GC GC/MS M.E.SNOOK 路鑫HPLC Marko-Varga 固定相、流动相、pH 值 Bocchi 氰基柱 Andersen C18柱,烟草中酚酸类化合物的分析方法,样品前处理,称取5g样品置于250毫升平底烧瓶内,加入100毫升1N的NaOH水溶液，80水浴回流4小时,加入HCl酸化，离心，取上层清液过固相萃取小柱,2%的甲酸溶液淋洗后加甲醇洗脱，收集洗脱液，进样,HPLC分析条件,流动相A：1%乙酸水溶液流动相B：1%乙酸乙腈溶液色谱柱：Waters XBridge Shield C18 5m 1504.6mm柱温：30柱流量：1ml/min检测器：DAD 检测波长：275nm,梯度：,标样（上）与烟草样品（下）的液相色谱图,烟草中酚酸化合物的标准曲线和检测限,注：X:浓度比（g/mL）Y：峰面积比,烟草中酚酸类化合物重复性测定结果,烟草中酚酸类化合物回收率测定结果,不同类型烟草中酚酸类化合物测定结果,不同类型烟草中酚酸类化合物含量比较图,色素分类,1、按来源分：植物色素：叶绿素、胡萝卜素、花青素动物色素：血红素、类胡萝卜素微生物色素：红曲色素2、按化学结构：四吡咯衍生物（卟啉衍生物）：叶绿素、血红素、胆色素异戊二烯衍生物：类胡萝卜素酮类衍生物：红曲色素、姜黄素醌类衍生物：虫胶色素、胭脂虫红等3、按溶解度：水溶性（叶绿素）、脂溶性（类胡萝卜素）,四吡咯衍生物-叶绿素,环中间以共价键或配位键与不同元素结合，如Mg易溶解于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等游离叶绿素对光和热敏感酸性条件加热，叶绿素脱镁形成脱镁叶绿素稀碱条件加热，水解生成叶绿酸盐酶作用下，叶绿素水解，生成叶绿酸、和 叶绿醇叶绿素在金属离子作用下生成铜或锌的叶绿素复合物，绿色稳定,颜色：红色、黄色呈色基团：共轭双键，越多，越偏向红色，至少含7个，呈黄色存在状态：游离、结晶、结合 1）与脂类结合：类胡萝卜素酯 2）与蛋白质结合：龙虾壳的兰色，加热，与蛋白质分离，生成虾青素，砖红色 3）与碳水化合物结合：藏花素-藏花酸与龙 胆二糖结合,异戊二烯衍生物-类胡萝卜素,叶绿素a与叶绿素b的结构,叶绿素 a和叶绿素 b的差别仅是 a 中一个甲基被 b 中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。,叶绿素a与叶绿素b,在乙醚提取液中，叶绿素a和b在蓝紫光波段最大吸收峰分别在429与453纳米，此外，在红光波段也有一个吸收峰，分别为660和642纳米。叶绿素a的红光吸收峰比叶绿素b的高，而蓝紫光吸收峰则低于叶绿素b的。在漫射光中，蓝紫光较丰富，而阴生植物富含叶绿素b，可吸收更多的蓝紫光，所以，叶绿素b有阴生叶绿素之称。,叶绿素a与叶绿素b的光谱特征,烟叶中的叶绿素,叶绿素在活体细胞中与蛋白质结合，形成蛋白质-色素复合体细胞衰老时，叶绿素被释放，游离出来，易分解叶绿素含量随烟叶成熟度提高而下降,叶绿素含量，烟叶颜色与成熟度,实践上人们通过观察烟叶颜色判断成熟度类胡萝卜素与叶绿素共存时，对烟叶的颜色影响较小，当叶绿素逐渐消失时，其影响才显现出来：叶黄素呈黄色、胡萝卜素呈红色，二者的比例决定烟叶的颜色。叶绿素含量达到mg/g（干重）时，烟叶完全成熟。,类胡萝卜素,类胡萝卜素是由8个类异戊二烯单位组成的一类碳氢化合物及其氧化衍生物。基本结构是番茄红素，其它类胡萝卜素是由其氧化、氢化、脱氢、环化以及碳架重排、降解而衍生。一般类胡萝卜素是C40分子，但也存在高类胡萝卜素(C45和C50)和降解的类胡萝卜素(如C30)。,类胡萝卜素的种类及分类,现已知结构的类胡萝卜素近600种，柑桔中有115余种。其中含量最大的四种是岩藻黄素(fucoxanthin)、叶黄素(黄体素，lutein)、堇菜黄素(violaxanthin)和新黄质(neoxanthin)。这些类胡萝卜素可分为胡萝卜素和叶黄素两大类。胡萝卜素是不含氧的类胡萝卜素的总称，而叶黄素是含氧类胡萝卜素的总称。,胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即 a,和-胡萝卜素，其中异构体含量最多，也最重要。在生物体内，异构体受酶催化氧化即形成维生素 A。叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。,胡萝卜素和叶黄素,烟叶中的类胡萝卜素,类胡萝卜素存在于叶绿体和有色体中类胡萝卜素比叶绿素耐热，也耐pH值的变化，强氧化剂才会破坏它类胡萝卜素总量随烟叶成熟度提高而上升,烟草中类胡萝卜素的存在、降解和转化,烟草中存在的类胡萝卜素主要有：六氢番茄红素叶黄素、胡萝卜素新叶黄素叶红素等,胡萝卜素（carotene）,a b c d e,a b c d e,a b,a b,类胡萝卜素降解产物,是烤烟中确定的重要香气成分,它们产生香味的域值相对较低、刺激性较小、香气质较好、对烟气香气供献率大巨豆三烯酮具有可可香味,可增加烟气的舒适口感,改善侧流烟气香气-大马酮和3-羟基大马酮可产生玫瑰花香和甜香3-氧化紫罗兰酮呈现柔和的清甜香和花香香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯可增加烤烟香气和抑制刺激性等。,烟草中色素的液相色谱分析方法,a)色谱柱：Nova Pak C18（3.9150mm，4m）b)流动相：溶剂A 异丙醇溶剂B 80%乙腈的水溶液（体积比）c)流速0.5mL/mind)进样量：10Le)柱温：30；f)检测波长：450nm。流动相的梯度条件,烟草中色素的液相色谱图,保留时间：10.284min 新黄质；12.802min 紫黄质；19.148min 叶黄素；27.239min 叶绿素b；29.763min 叶绿素a；36.418min-胡萝卜素,色素液相色谱分析图,不同部位、等级和成熟度的烟叶中色素的分析,对于总类胡萝卜素含量是中部叶含量较高，上部叶次之，下部叶较低。不同等级的中部烟叶中总类胡萝卜素含量相近，不同等级的下部烟叶中总类胡萝卜素含量也相近；对于胡萝卜素、叶黄素及其它类胡萝卜素其含量规律近似于总类胡萝卜素的含量。上部叶类胡萝卜素及其与叶绿素的比值都随成熟度的提高而上升，中部叶在成熟度一般时类胡萝卜素含量较高。,新鲜烟叶中叶绿素含量高,随烘烤的进行,其含量不断减少,变黄期结束后,叶绿素几乎分解完全,烘烤过程中类胡萝卜素也减少,但变化不如叶绿素显著。烟草中色素变化在变黄期非常剧烈,到变黄期结束烟叶充分失水后变化开始变得平缓,说明色素的降解和烟叶失水是密切相关的。,许多研究表明,烟叶中残留的叶绿素过多,将使烟叶产生青杂气。较好地把握好烟叶采收成熟度和烟叶调制技术,使叶绿素得到充分降解,将获得香气质和香气量优良的烤烟叶。类胡萝卜素的合成、积累与烤烟产区的紫外光强度及温度密切相关,同时类胡萝卜素在烟叶成熟和调制过程中的降解速率大大低于叶绿素。在高海拔或低纬度地区种植的烤烟,因紫外光强度高,昼夜温差大,所以有利于烟叶中类胡萝卜素的合成和积累。,类胡萝卜素的合成与遗传、光照、温度和碳素代谢等因素密切相关,因此,在烟叶生长和成熟期采用适宜的调控技术,促进类胡萝卜素的积累,减少烟叶在调制过程中类胡卜素的降解,将有利于烤烟香气质和香气量的改善和提高。烤烟成熟期和调制过程中类胡萝卜素与叶绿素的比值对选择适当的采收时期和调制温度具有一定的指导作用。,烟草中的萜醇,烟草中的萜醇类物质主要有两类，即西柏烷类(Cembraniods)和赖柏当类(Labdnoids)。代谢过程中产生的一系列包括单萜、双萜以及四萜类等重要致香物质。单萜主要有薄荷醇、柠檬醛、香叶醇等，它们是烟草叶面挥发物的主要组成成分。,烟草中的萜醇,双萜是叶面腺体胶质分泌物的主要组成成分，其中类西柏烷类化合物是烤烟主要的表面致香成分，它存在于烟叶的角质层上，主要成分是西柏三烯二醇。西柏三烯二醇调制后大部分降解，主要降解产物是茄酮及其衍生物，茄酮本身具有很好的香气，其转化产物茄醇、茄尼吠喃、降茄二酮等也是重要的香味物质。,类西柏烷化合物,西柏烷二萜的骨架如图1-1a所示，共含有20个碳，其中母环上有14个碳。西柏烷二萜在烟草中分布较广，主要以一醇或二醇的形式存在。此外，也发现以三醇和四醇形式存在的西柏烷二萜。,类西柏烷化合物的降解,类西柏烷化合物的降解,类西柏烷化合物的降解,赖百当二萜,赖百当二萜的骨架如图a所示，共含有20个碳，其中母环上有10个碳。赖百当二萜在烟草中的分布不如类西柏烷二萜广，其主要存在于香料烟和雪茄烟中。香料烟中普遍存在的赖百当二萜是顺冷杉醇(图b)，化学名称为(12-Z)-赖百当-12,14-二烯-8-醇。,赖百当二萜,赖百当二萜的降解,赖百当二萜的降解,高效液相色谱,吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱,色谱分离方法的选择相对分子量,分子量2000，凝胶色谱柱,分子量2000，但同时分子量相差10%，凝胶色谱柱,分子量2000的水溶性电解质，酸性物质用阴离子交换树脂，碱性物质用阳离子交换树脂,分子量2000的水溶性非电解质，选用反相色谱法,分子量2000的非水溶性物质，弱极性物质选用反相色谱法，极性物质选用正相色谱法。,烟草表面化合物的分析方法,衍生化GCMS法LC,LC-MS法,衍生化GCMS法测定西柏烷三烯二醇,N,O-双三甲基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化,衍生化GCMS法,N,O-双三甲基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化,LC,LC-MS法,LC,LC-MS法测定冷杉醇,热裂解气相色谱质谱法,Py-GC是热裂解和气相色谱两种技术的结合。Py-GC 分析系统主要由三部分组成：裂解器、色谱仪、控制和数据处理系统。Py-GC可初步模拟模拟卷烟燃烧状态，预测烟草添加剂在卷烟燃烧过程中的行为，研究烟气中有害成分的形成机理。其局限性是不易检测不稳定的中间体和难挥发的裂解产物、定性鉴定比较费时、重现性不是很好。,绿原酸的热解,咖啡酸,苯甲酸衍生物和氢醌,奎尼酸,烷基儿茶酚,JT,类胡萝卜素的裂解,类西柏烷的裂解,类赖百当的裂解,蔗糖酯的裂解,糖酯类化合物,在许多茄科植物的腺毛分泌物中均发现了糖酯，各种烟草中的糖酯相对于其它分泌成分的量引起了人们的关注。它们以蔗糖酯、葡萄糖酯或其混合物的形式出现。烟草中的糖酯主要是指蔗糖酯(Sucrose Esters，SE)和葡萄糖酯(Glucose Esters，GE)。裂解生成小分子量的有机酸，如异戊酸、一甲基戊酸和异丁酸，对烟气感官品质有明显影响。,蔗糖酯类化合物,普通烟草(Nicotiana tabacum L.，又称红花烟草)烟叶表面所含的蔗糖酯结构如图1-3所示，化学名称为6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-酰基-D-吡喃葡萄糖苷-D-呋喃果糖苷。根据分子量的不同，蔗糖酯大致分为六组,蔗糖酯类化合物,蔗糖酯类化合物的分析方法,薄层色谱法，由于蔗搪酯本身不显色，需用显色剂显色，薄层色谱操作简单快捷。气相色谱(GC)，但需对蔗糖酯进行硅烷衍生化，过程较繁琐。高效液相色谱(HPLC)，紫外检测和示差检测都已被用于蔗糖酷的分析。但蔗糖酯的紫外吸收比较弱，而示差检测器不能梯度洗脱。因蒸发光散射检测器可梯度洗脱，是蔗糖酯定量分析的一种比较合适的检测器。,烤烟成熟期烟叶表面蔗糖醋含量的变化,随着烤烟叶片的成熟，上部叶和中部叶中表面蔗糖酷总含量在打顶后0一28d的时间段里基本呈上升的变化趋势，在打顶后28一35d里开始缓慢回落，且品种间都是上部叶的蔗糖醋含量均高于中部叶蔗糖酷含量。,烟草糖苷类化合物简介,Flavanoid and coumarin glycosides,R=glucose,rhamnoglucose,R=rhamnoglucose,R2=H,R1=glucose,rhamnose,rutinoseR2=H,R2=glucoseR1=rutinose,R2=glucose,flavanoid glycosides,Coumarin glycosides,R1=glucose,R2=HR1=CH3,R2=glucose,rhamnoglucose,xyloglucose,gentiobiose,ionone-related glycosides,R=glucose,sesquiterpene-derived glycosides,R=glucose,R=sophorose,R=sophorose,R1=R2=H,R3=glucoseR1=R3=H,R2=glucoseR2=R3=H,R1=glucose,Proposed aglucones from flue-cured tobacco 3-methyl butanol benzyl alcohol 2-phenylethanol 2-methoxy-4-vinylphenol 4-vinylphenol 2,6-dimethoxy-4-vinylphenol 1,2-epoxy-4-hydroxy-inol 3-(2-hydroxyethyl)-phenol 1-hydroxy-4-keto-ionone,烟草糖苷类化合物的重要性,重要香味前体物,挥发性低 加工和存储过程中相对稳定 燃吸时，热裂解释放苷元 苷元可能每口均匀释放,糖苷检测方法,传统植化分离，质谱、核磁鉴定水解或酶解，GC-MS LC-MS direct infusion-MS/MS(Energy-gradient neutral loss scan)MALDI-TOFMS,烟草样品单四极液质谱图,MS/MS Constant Neutral Loss,图中Q1和Q2的电压同步扫描,但保持一个特定m/z值的电压差。Q1和Q2的电压差值与碰撞室内碰撞消除的一个特定中性分子的质量一致。因此，在离子混合物中，只有碰撞裂解后能丢失这一特定基团的离子才会被Q2传输到检测器。,孕酮的检测,烟草样品中性丢失扫描色谱图,烟草样品中性丢失扫描色谱图,609,593,谢 谢,