《镜检技术》PPT课件.ppt

疟原虫的镜检技术血涂片制作与染色,荣成市疾病预防控制中心 E-mail:,主讲内容：,厚薄血膜的制作与染色。疟原虫计数方法。疟原虫人体内生活史简介。相关注意事项小结。,疟疾的实验室诊断,1.病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性；这种镜检确诊最可靠。2.免疫学诊断：（1）循环抗原的检测（2）循环抗体的检测3.分子生物学技术：PCR和DNA探针已应用与疟疾的诊断。分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾的“金标准”仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。快速诊断试纸条可与镜检疟原虫相互补充。,血膜的制作（取血时间）,采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。发热期，外周血中以环状体（小滋养体）为主，也可见到裂殖体；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发作后数小时（h），间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，初发患者退热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状体之后的10天左右。,血膜的制作（取血操作）,在采集标本、制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址。采血部位和方法：采血部位一般人为耳垂，指头；一人一针，常规消毒、采血。,取血部位和血量,采血部位和取血方法：耳垂或无名指（婴幼儿母趾或足跟），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒大米（即火柴头）大小。采血详细部位、取血方法有小技巧。,血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。无特殊要求的可厚薄血膜分载玻片涂制。,发热病人血片,标本片,血膜的制作（涂片操作）,涂制厚、薄血膜的位置 通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人，涂2个厚血膜1个薄血膜，以防血膜脱落而影响检查；,标本片,发热病人血片,标签,薄血膜的制作,薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分取约11.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25350夹角，待血液向两侧扩展约 2cm2.5cm宽时，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕，位于玻片1/21/3处【左半部分（或第46份）】。,熟练工作者的推片姿势,厚血膜的制作,厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取约45微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81cm大小圆形厚血膜(厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个自细胞为宜)，厚血膜的位置，位于玻片右1/3处中央偏右（或6等份中的与贴标签的1、2份相邻的第3份中部）。厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求，以油镜视野5-10个WBC为宜。,标准的疟疾厚薄血膜位置,各种不同的疟疾血片涂制法：,标准血片（1人）,门诊发热病人血片（1人）,居民普查血片（2人）,血膜的制作,血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。,染液的种类,染液种类：疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain）和吉氏染液（Giemsa stain）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。我们主要用吉氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室使用。,染液的染色原理,染色原理是染料于被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。红、白细胞和疟原虫所含蛋白质的氨基酸电离出的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带的阴阳离子相互结合便被染上不同的颜色。疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色，红细胞、疟原虫和白细胞核被染成紫红色。红、白细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷的-NH3+和一个带负电荷的-COO-。多色染剂的碱性染料美蓝的有色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷的-COO-部分结合，使之成为蓝色。疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质，故被染成蓝色。酸性染料伊红的有色基团带阴离子，可与细胞中带正电荷的-NH2+部分结合，使之呈红色；但美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着色，可美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，于是，在媒染物与染料的共同作用下，疟原虫和白细胞核被染成紫红色。,染液的种类及染色原理,注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液的pH值较好。染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。,姬氏染液母液配置方法,取姬氏粉0.5克置于研钵中，加25ml甘油充分研磨，倒入60或100ml带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至25ml甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24h或室温内35天，多加摇动，即成原液。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。材料：1、姬氏粉0.5克 2、甘油25ml 3、甲醇25ml 注意事项：1.高纯度试剂。2.所用器皿绝对无水（伊红在水溶液内遇到美蓝或天青即可互相化合而产生沉淀，从而失去染色力）。3.边加边磨，充分研磨；整个染色液配制时间不能少于5个小时。,姬氏染液的染色方法,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜,再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后再进行染色。注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液1-2滴，加中性蒸馏水15-30滴，染色30分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。,操作1（快染）配制5%染液，（每张血片约需染液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。（一般配制5%-10%，染色时间短，一定掌握好时间。）操作2(慢染)配制3%染液：在染色量筒内量2ml蒸馏水或新鲜凉开水，再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。（一般配制2.5%-3%染液，染色效果稳定。）,吉氏染液浓度,门诊染色,全国疟疾镜检知识与技能竞赛的 竞赛内容及分值比例1.理论知识竞赛内容为：疟疾病原和诊断基本知识。包括：疟原虫生史，血片制作、染色、镜检操作理论，显微镜使用与维护知识。2.技能竞赛内容为：制片染色和镜检读片。包括：厚、薄血片的制作和染色；疟原虫的显微镜镜检，确定阴阳性和虫种，定量计数以及显微镜的使用与维护。3.分值比例：每位选手满分100分，其中理论竞赛20分，技能竞赛80分；技能竞赛中，制片染色15分，镜检读片60分，显微镜使用与维护5分。将来咱们省内竞赛内容及分值比例参考该标准。本次培训测试降低难度。,全国疟疾镜检知识与技能竞赛血片制作和染色质量评价标准好血片制作质量:厚血膜：血量 4.05.0ul,位置 玻片右13稍偏右,直径 0.81.0cm，外观 圆形厚薄均匀。薄血膜：血量 1.52.0 ul，位置 玻片1213处，外观 舌状厚薄均匀；染色质量 外观兰紫色；清洁度 外观光洁无油灰。讲义43页倒数第二行厚血膜用血量10ul-20ul错误，应更正为。,影响染色效果的因素,（1）染剂、溶剂的质量（2）染液的新旧（3）染液稀释后使用时间（4）染液的稀释浓度（5）染色时间（6）染色用水（7）冲洗方法,如何确定疟原虫血片为阴性,检查全部厚血膜未查见疟原虫。最少检查100个厚血膜油镜视野未查见 疟原虫。镜检时间最少不低于20分钟。,借助疟原虫生活史简图，复习一下红内各期原虫形态,生 活 史,含成熟疟原虫子孢子按蚊 叮咬人 子孢子随唾液进入人体血液 约30分钟 侵入肝细胞 裂体增殖 成熟裂殖体（含数以万计裂殖子）肝细胞破裂 裂殖子侵入红细胞（开始红细胞内期发育）发育 小滋养体（环状体）摄食营养、发育 大滋养体 核分裂、发育 未成熟裂殖体 核进一步分裂 裂殖体（成熟）被寄生红细胞破裂 裂殖子释放入血流 一部分被巨噬细胞吞噬。一部分再侵入红细胞，开始新的一轮发育。一部分裂殖子在红细胞内不再进行裂体增殖，而发育成雌，雄配 子体。在蚊体内进行有性生殖。由生活史容易看出，疟原虫对人体的主要致病阶段是红 细胞内期的裂体增殖期；主要是指红细胞内期的无性体小 滋养体到成熟裂殖体，而不是红细胞内期的无性体配子体；可 具有流行病学意义的疟疾传染源为外周血内有配子体 的现症病人和带虫者，可见早期诊断治疗的重要性。复发由肝内期 迟发型子孢子引起。,人类四种疟原虫的基本特征,感染人的疟原虫有四种:恶性疟原虫 P.falciparum 间日疟原虫 P.vivax三日疟原虫 P.malariae 卵形疟原虫 P.ovale,恶性疟 P.falciparum,四种疟原虫中致病力最强；无免疫力者感染后出现急性症状，不及时治疗可危及生命；在我国主要流行云南省和海南省。,间日疟 P.vivax,间日疟原虫分布于我国大部分地区，主要是中部地区。引起间日疟，病程呈良性，但有复发。,三日疟 P.malariae,三日疟在我国已基本消灭。主要发生在晚秋及初冬，无复发。三日疟的大滋养体有其特殊性，其胞浆形态常呈 带状。卵形疟 P.ovale又称蛋形疟原虫，在我国已基本消灭。引起症状与间日疟相似，但很少复发。,疟色素的形成,血红蛋白消化,珠蛋白氨基酸合成原虫蛋白,血红素 高铁血红素疟色素,原虫密度计算,估计疟原虫感染程度有三种方法：半定量计数法 检查厚血膜白细胞原虫密度计数法检查厚血膜红细胞感染率计算法检查薄血膜白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）主要 用于疟疾研究 用于临床诊断 用于抗疟后疟疾考核,在厚血膜，按要求选择视野，计数200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（500 1 000 个）。白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数 患者每微升血的白细胞数 计数的白细胞数=疟原虫数/l血。如果不知患者的白细胞数，则每微升血以 8000个白细胞计算(国际标准)，国内按6000个白细胞计算。,白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）,计数方法 从血膜的左上角开始，横向。计数1个视野后间隔5个视野再计数。在1个视野中，有时会重复计数。先把视野分成4个象限，从右上象限起顺时针方向计数整个视野。,白细胞疟原虫计数法举例,假设计数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为：,35（原虫数）x 8000200（白细胞数）=1400/l,答：该患者原虫密度为1400/l。疟原虫计数，应根据原虫数量的多少确定计数WBC的个数，一般100-200个，若原虫密度较低，可增加白细胞计数（500 1 000 个）。,2012、2015年工作指标小结,1、技能培训：实验室检验人员疟原虫血片镜检技能培训的比例：2012年应在95%以上，2015年100%。2、发热病人疟原虫血检。（1）二、三类县的综合医院和疾病预防控制机构能够开展疟原虫血片镜检的比例达到100%；二类县的乡级医疗机构能够开展疟原虫血片镜检的比例达到90%，2015年100%。（2）二类县“三热”病人以乡镇为单位年疟原虫血检的总数分别不低于辖区人口数的1%；三类县“三热”病人以县为单位年疟原虫血检的总数不低于辖区人口数的2。（3）疟疾病例实验室检测率达到100%，实验室确诊比例达到75%，2015年100%。县级疾病预防控制机构负责对网络报告的所有疟疾病人血片进行复核，并抽查至少5%的发热病人阴性血片。,血膜制作与染色的注意事项,1.清洗玻片，且勿碰撞、磨损。2.刚涂制的血膜要平放，注意防尘、防昆虫吸吮血膜。厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时装入标本盒并盖严。3.血膜应自然干燥。切忌在毒太阳下晒或火烤，以免原虫变形；一般等厚血膜干透后再用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能在48h内固定染色；冬天也不能超过72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果越差。若不能及时染色，宜先用甲醇固定（1-3分钟）薄血膜，再溶解厚血膜，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。千万固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜。4.母液配好后过滤杂质颗粒，有助于提高镜检质量。5.冲洗染液时，不要冲走厚血膜。,