《过柱纯化》PPT课件.ppt

6、电泳、割胶、纯化DNA,1、实验目的：(p140)将所需要的DNA片段进行回收，纯化。（TaKaRa公司 凝胶回收试剂盒）2、实验原理：,实验操作,1.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶 表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率*。2.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提 高DNA的回收率。3.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1l 进行计算。4.向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下 表：5.均匀混合后75加热融化胶块(低熔点琼脂只需在45)，间断 振荡混合，使胶块充分融化（约610分钟)。*切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。,6.加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。7.将溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液(可重复一次，提高DNA回收率)。8.将500 l的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30s，弃滤液。9.将700 l的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒，弃滤液。10.重复操作步骤9，然后12,000 rpm再离心1分钟。11.将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入25 l 的灭菌蒸馏水*，室温静置1分钟*。12.12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA。*把灭菌蒸馏水加热至60使用时有利于提高洗脱效率。,mark,未纯化前质粒DNA,未纯化前质粒DNA,未纯化前PCR产物,