醋酸纤维薄膜电泳实验总结.ppt
血 清 蛋 白 的 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳,生 物 化 学 实 验,一、实验目的,学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理,二、实验原理,电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小,三、实验仪器,1、DYY-8C型常压电泳仪：北京六一仪器厂生产，1套/2组,2.醋酸纤维薄膜（2 cm8cm）：2片/人。3.培养皿：一排桌子（即4组）公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.点样器：一个/组。5.滤纸：公用。6.玻璃板：一块/组。7.镊子：一个/组。8.玻棒：公用。,四、实验试剂,1巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）：巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，用蒸馏水定容至1000mL。2染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重复使用）。3漂洗液：甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混匀。4.人或动物血清：从医院或自制，冰冻保存，现取现用,五、实验过程,浸泡：将28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。将粗糙面朝上置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡20min方可用于点样点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线,五、实验过程,电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥,五、实验过程,电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电，调节电压至160 V，电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约25 min 染色：电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱,六、注意事项,保持薄膜清洁，务必戴上塑料手套，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物沾上，影响电泳结果。注意醋酸纤维膜的质量，至少浸泡10分钟，浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃之不用。加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。以免影响蛋白质区带图谱的完美。电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上，槽里的缓冲液要保持清洁。电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.40.6mA/cm,电压110160V，通电时间4060min。电压高，电流大，电泳速度加快，时间可缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。使用比色皿时要润洗。染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多蛋白条重叠在一起。注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要与滤纸接触了。通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。,七、实验结果,从左至右分别为血清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白、点样处,04,06,07,09,八、失败图谱分析,拖尾状：点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成5条区带或产生拖尾。有斑点：点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出现斑点。边流现象：点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带分离不清，出现边流现象。区带模糊：薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。锯齿状：薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白斑）或点样过慢，又未及时大桥，导致薄膜过于干燥，使区带成锯齿状。区带倾斜：薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行，或点样一边多一边少，区带容易泳斜。显色过浅：点样太少，区带显色不明显。区带重叠：染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。区带过密：电泳时电压，电流或电泳过小或时间不够，造成区带未分离。,实验结果既有清晰的图谱，也有模糊不清的图谱,九、实验思考,1、为什么要将点样一端放在电泳槽的负极？答：带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动。因为血清样品带负电荷，在电场中将向正极泳动，所以点样端要置于负极。2、电泳时电压表显示的电压是否等于加在膜条两端的实际电压，为什么？答：不相等。因为在实际中缓冲液两边离子不平衡。,九、实验思考,3、根据人血清中蛋白各组分的等电点，估计它们在pH8.6的巴比妥电极缓冲液中电泳移动的相对位置。答：,巴比妥电极缓冲液的pH为8.6，蛋白的等电点均低于它，因此蛋白带负电荷，向正极移动。速度为血清蛋白1-球蛋白 2-球蛋白-球蛋白-球蛋白。因此，在电泳图谱上位置由左向右依次为血清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白。,
