《药基基因工程》PPT课件.ppt

基因工程技术(Genetic engineering),2.基因工程（genetic engineering）：在分子水平上用人工方法提取或制备DNA，在体外切割，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把重组的DNA分子导入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同的蛋白产物或定向的创造生物的新性状，并使之稳定的遗传给子代。,一、基本概念,1.基因（gene）：是生物体传递遗传信息和表达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部核苷酸序列。,分：目的基因的获取、载体的选择切：限制性内切酶的应用接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体转：将重组体导入到受体细胞筛：采用适当的方筛选出含有目的基因的阳性克隆表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物,二、基因工程的基本程序：分、切、接、转、筛、表,分,切,接,转,筛,表,三、基因工程实验特点及要求,1.微量操作 2.连续性操作 3.低温操作 4.防止污染（杂质污染、细菌污染）5.实验物品切忌乱扔乱丢 6.认真写好实验纪录,第一次实验:质粒DNA大量制备、浓度分析第二次实验：DNA限制性内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接第三次实验：重组质粒的转化、PCR 第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNA小量快速制备）、杂交第五次实验：显色、考试,实验一 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析,目的：获得高浓度、高纯度的质粒DNA。为酶切和基因转染作准备。,质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的环状双链DNA,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,载体的选择标准,能自主复制；具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,基本步骤：,细菌的生长和质粒的扩增:将表达质粒DNA的活细菌进行大量培养。细菌的采集和裂解,抽提质粒DNA：碱变性法提质粒；质粒DNA的提纯:除蛋白质、RNA和与质粒DNA分子量相近的断裂染色体DNA。,碱变性抽提质粒DNA原理：,利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同，变性和复性的差异。在pH=12.6的NaOH-SDS环境下，质粒DNA与染色体DNA的氢键均破坏，但是染色体DNA断裂成线状，而质粒DNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当pH调整到7.0，质粒DNA复性存在溶液中，而染色体DNA不能复性与变性的蛋白质、SDS相互缠绕形成沉淀，经离心被分离。,质粒DNA的纯化：,蛋白质的清除：蛋白质的变性剂酚和氯仿.RNA的清除：RNA酶消化；LiCl沉淀;层析。与质粒分子量相近的线状断裂的染色体DNA的清除：等体积1.6mol/L NaCl,13%PEG;CsCl梯度超速离心等。,CsCl密度梯度超速离心法：,CsCl是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离心后，形成浓度梯度，当DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡时，染色体DNA、质粒、RNA等各分离颗粒，在密度梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置分布不依据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取决于密度。EB是一种丫啶类染料，可嵌入双链DNA的碱基之间，使DNA的解旋体积增大，浮力密度变小。EB与环状质粒DNA的结合量小于线状染色体DNA的结合量，故质粒DNA的浮力密度大与线状染色体DNA,位于离心管的下层。RNA总是与Cs+结合，密度最大，超离时位于管底。,Sepharose 2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）,利用分子筛效应，分子量大的分子不能进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经内，流程长，后流出来。质粒DNA分子量大于RNA，故先洗脱下来。,LiCl沉淀法：Li+可与RNA结合，形成锂盐沉淀，而DNA不与锂结合，故经离心可将二者分离。注意在变性阶段，操作要温柔，不要使染色体DNA断裂。聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状DNA,操作步骤:,收集细菌,GET,悬浮,SDS-NaOH,pH=12.6,碱变性,KAc,pH=4.8,质粒DNA完全复性,染色体DNA不能复性,离心,上清:质粒,小分子RNA,少量蛋白质,沉淀:染色体DNA,大分子RNA,SDS-蛋白质复合物,取上清,加等体积异丙醇沉淀DNA(缩小体积),离心,沉淀溶于TE,等体积LiCl,沉淀RNA,离心,加等体积酚氯仿异戊醇,去杂蛋白,离心,取上层水相,酚氯仿异戊醇重复一次,离心,取上层水相,2倍体积无水乙醇0.1体积NaAc,沉淀DNA,离心,70%乙醇清洗沉淀,晾干,TE(50ul)溶解沉淀,取5ul电泳鉴定,取上清,加等体积异丙醇沉淀DNA(缩小体积),离心,沉淀溶于500ul TE，RNA酶消化30min,DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离,原理以琼脂糖为电泳支持物，DNA因分子大小、形状、构象不同，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带。DNA可与荧光染料Goldview结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光条带。琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-99），近似自由电泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定，制成干膜可长期保存。,DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素：,1.核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反比，但当20kb时，迁移率不在依赖于分子大小；2.核酸构型:分子量相同的情况下，共价闭环DNA直线DNA开环环状DNA 3.与凝胶浓度关系:一定大小的DNA在不同凝胶浓度中迁移率不同；4.其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及电压（5v/cm）等,DNA浓度及纯度分析:紫外分光光度法,双链DNA:1OD260nm=50ug/ml单链DNA或RNA:1OD260nm=40ug/ml核苷酸:1OD260nm=20ug/ml,RNA:,OD260nm,OD280nm,2.0,DNA:,OD260nm,OD280nm,=1.7,2.0,蛋白质污染,1.7,RNA污染,1.7,蛋白质污染,结果分析：,线状DNA,超螺旋DNA,第二次试验：构建重组DNA,载体的酶切消化酶切产物琼脂糖凝胶电泳DNA片段回收目的基因、载体重组连接,一、质粒DNA的限制性内切酶消化酶解,原理 限制性内切酶（restriction enzyme）是细菌体内含有的一类能特异识别双链DNA分子的特定序列，并对其进行切割的核酸内切酶。共有三类，其中二类因其有固定的切割位点，只有酶限制性无修饰性，不需要ATP，实用性大，是基因工程常用工具酶之一。作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。其识别序列特点及酶切产物：4-6bp，回文结构；粘性末端或平端,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,命名方式（以Hind III为例）：属：HHaemaphilus 种：ininfluenza 株：d株 编号：,同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,限制性内切酶（）单位及实际用量：在限定的温度和反应环境中，小时消化1ugDNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，一般使用3-5u/ugDNA，延长小时以上，是酶切反应更彻底。RE保存条件：50%甘油中，用时需稀释10倍以上才能解除抑制。,酶切系统组成及计算方法：根据DNA量计算酶的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的用量。,质粒DNA10ug(10ul)1ug/ul 10 RE 30-50U(1.5-2.5ul)20U/ul d3H2O 6ul 总体积15-25ul 加样顺序：先加水，再加buffer和DNA，最后加酶,操作步骤：,质粒DNA 20ul(10ug)10buffer 3 ul Xbal 1.5 ul(30U)Hind III 1.5ul(30U)d3H2O 4ul 总体积 30ul 加样，短暂离心，370C水浴消化。,三、DNA片段回收及纯化,DEAE纤维素膜的电泳回收方法：紧靠目的DNA片段前方切一裂隙，将一条DEAE纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至条带中所有的DNA均收集到膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将DNA洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多片段，且获得的DNA极纯，但仅适用于小片段DNA（15Kb的DNA片段和单链DNA不适合，因难以洗脱下来。,三、DNA片段回收及纯化,透析袋电洗脱法：将含有DNA片段的凝胶切下置于充满1xTAE的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在1xTAE电泳槽中，电泳2-3小时，使DNA从凝胶中电洗脱下来。此法可以回收大小范围较宽的DNA，但很不方便。从低溶点琼脂糖凝胶中回收DNA：琼脂糖的糖链上引入了羟乙基，在300C左右成胶，大约在650C熔化，在大多数双链DNA熔点温度以下。采用挖槽法酚冻法。,纯化：,1.DEAESephacel柱层析法：将带负电荷的DNA结合到一种阳离子基质上而将污染物洗脱下来，在提高缓冲液的离子强度将DNA 洗脱下来。2.有机溶剂抽提法：用2-丁醇和酚氯仿抽提。,制胶点样电泳分离回收片段抽提沉淀DNA。,操作步骤:,结果分析：,分子量标准：噬菌体的DNA，全长49.01kb，经Hind消化产生7条带，23.7kb,9.46kb,6.75kb,4.26kb,2.26kb,1.98kb,0.58kb完全酶解的质粒有两条带及目的基因和载体，分别为1.1kb和5.4kb，应位于1.98 和0.58kb及之间溴酚蓝前的绿色带为RNA若酶解未完全可能出现超螺旋、线性、开环三种构象。,marker,plasmid,RE digested,四、DNA片段的重组连接,原理 1.在T4DNA连接酶的催化下，载体基因片段与目的基因片段的粘性末端共价结合,连接,环化成重组环状DNA分子。,2.连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头器3.影响重组连接因素:目的基因的浓度与载体的比例(3-5:1)；离子浓度；温度：14-160C。4.DNA连接酶单位：用Weiss单位对酶进行标化：1个Weiss单位指在370C下20分钟内催化1nmol32Pi从焦磷酸根置换到,-32PiATP所需的酶量。,（三）外源基因与载体的连接,1.粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端,3.同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,4.人工接头(linker)连接：由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,连接体系,目的基因：8ul载体质粒 2ul10 xBuffer 1.5ulT4 DNA连接酶 1ul水 2.5ul,总体积：15ul,第三次实验 感受态细菌的制备及转化实验,原理 1.将重组DNA分子导入受体细菌中进行复制扩增，再进行检测，以获得正确的阳性重组体。将重组DNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。一般受体细菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。后来人们发现，用氯化钙处理后的细菌细胞对DNA的摄取能力大为增加，转化效率提高。这种细菌细胞能摄取外来DNA的生理状态称为感受态，此阶段的细菌称感受态细菌。,2.感受态形成假说：局部原生质体假说：用特定的化学或物理因素处理细胞后，局部的细胞壁被破坏，形成一些小孔，允许外来DNA分子进入。酶-受体假说：用特定的化学或物理因素处理细胞后，细胞壁是完整的，但在壁上产生了一些酶的位点，可以把外来DNA转入胞内。,3.制备方法：电击法:将细菌置入一定的容器内，通入高脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效率高，可达1010/1ugDNA，但细胞容易死亡，约一半以上的细胞死亡。化学法：如：Ca2+、DMSO、还原剂、氯化六氨合高钴等，成功率可达105-8/ug DNA。,4.受体菌的改造与选择：,限制与修饰系统：R-,M-或R-,M+的突变体，（R：restriction;M:modification）重组系统：选用rec+的转化（提高转化效率），再转到rec-受体菌中保存（防治整合到染色体DNA基因组中去）。有明显的选择性差异：例如，载体Ampr,目的基因Strr，应选择Amps/Strs的受体菌。空菌选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌：肺炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。,转化时期选择：,细菌生长时相分为：静止期、对数生长期、稳定期和衰亡期。转化最佳时期应选择在对数生长期的后期。OD550nm（5-6108细胞/ml）,5.转化：外来DNA进入细菌内部的过程。,具体过程：a.吸附：dsDNA吸附在细菌表面；b.转入：一条ssDNA进入细胞并被蛋白质保护起来，另一条降解；c.自稳：ssDNAdsDNA；d.复制表达*在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子，并将dsDNA吸附到胞壁上；在革兰式阳性菌中，因没有分离到感受态因子，DNA以双链进入。现选用一种常用制备感受态细菌的方法（CaCl2），供实验应用。细菌在低渗的CaCl2溶液中逐渐膨胀成球形，DNA与Ca2+形成羟基钙磷酸复合物，被吸附在细菌表面，细菌经短暂热休克刺激被细菌摄取。,操作步骤：（见讲义，穿插PCR、southern转膜）注意事项：1.冰浴操作，增加感受态量及延长感受态时间。2.无菌操作，防止杂菌污染。3.试剂要求纯度高 4.重组时的高盐，在转化时要稀释 5.涂皿时不要来回涂布,预期结果及结果分析：,1.正常结果：空白对照不长菌，阳性对照和重组组长菌。2.所有的皿都不长菌：转化系统有问题。3.都长菌：试剂或操作过程中被污染。4.连接不成功。,PCR,。PCR(polymerase chain reaction)聚合酶链反应，其原理是依据细胞中DNA半保留复制机理，DNA在不同温度下变性、复性的特性，人为控制温度高温变性、低温复性、适温延伸，循环多次后，可使目的基因得到扩增。以待扩增的DNA分子为模板，以一对分别于模板5末端和3末端互补配对的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程（变性、退火、延伸），即可使目的DNA片段得到扩增。,一、基本工作原理,PCR反应体系的基本成分：模板DNA（ng，无严格要求）；特异性引物（通常）；DNA聚合酶（2.5-5U）；dNTP(20-200umol/L)；含Mg2+的缓冲液（Mg2+1.5mmol/L,Tris-HCl pH8.3-8.8,KCl50mmol/L,明胶0.1%,甲酰胺5%）PCR的基本反应步骤：变性，退火、延伸，可循环25-30次，扩增效率为P=A*(1+X)n,三、PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,主要用途：目的基因克隆；基因的体外突变；DNA的微量分析PCR的特点：高度的敏感性；高度的特异性；操作简便，快速；广泛的适用性PCR在医学中的应用：遗传性疾病的基因诊断；病原体的检测；癌基因与抑癌基因的检测；在法医学上的应用。PCR引物设计原则：引物长度15-30bp；GC含量40%-55%；Tm高于550C；引物与模板非特异性配对的配对率70%;引物之间配对的碱基数3；引物自身配对3；引物3末端碱基原则上要求与模板一定要配对，最好选T，C，G，而不选A。,PCR,按表加样10*buffer 5ul dNTP（200umol/L）1ul 引物（10-100pmol）2ul模板（0.1-2ug）10ulTaq酶（2.5-5U）2ul MgCl21.5mmol/L）2ulH2O 28ul总体积 50ul,第四次实验 质粒DNA的小量快速提取制备,目的：为了证实所得的转化子的重组质粒DNA是否确实由载体质粒与目的基因组成，已排除其它可能方式的连接。常用鉴定方法：小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析；互补；插入失活；杂交筛选。正常重组DNA：经酶切电泳，可获得5.4kb的载体和1.1kb的目的基因。错误基因插入：不能酶切或片段大小不同。反向连接（出现在平端连接）：不被酶切或片段大小不同。载体自我环化：没有小片段。,（五）重组体的筛选 1.直接选择法：(1)抗药性标记选择(2)标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2.免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等,(插入失活法)抗药性标记选择,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,互补,互补的检测,原位杂交,Southern印迹,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,杂交,用来鉴定DNA中某一特定的基因片段。原理：根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能专一配对的原理进行。在一定条件下，单链DNA或RNA能与另一条单链DNA上互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交成双链核酸分子，通常利用以标记的某一DNA（或RNA）片段作为探针，探测核酸分子中是否有与探针同源的序列。,Southern 印迹杂交,放射自显影照片,实验步骤包括:,提取细胞内的染色体DNA，酶切电泳。凝胶上的DNA碱变性处理:因为大片段的DNA(15kb)转移不完全,转移效率取决于在其脱水前离开凝胶的分子所占比例。先经弱酸作用引起部分脱嘌呤作用，然后用强碱处理水解脱嘌呤部位的磷酸二酯键，产生的DNA片段可高效率转移,双链变成单链.Southern转移：毛细管转移(转移的速率取决于DNA片断的大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移；真空转移。制备探针：DNA的切口平移（利用DNA聚合酶具有35聚合活性和53外切酶活性进行标记）；随机引物合成预杂交，杂交及杂交信号检测,Dot blot(斑点杂交）,DNA转移固化探针标记杂交免疫检测,一、DNA转移固化待检测DNA的分离纯化DNA变性：1000C 10min快速置冰浴（作系列稀释：total 10ul,2ug,0.2ug,20ng,2ng,0.2ng,20pg,2pg）变性后的DNA点到NC膜上（NC膜先在10SSC中浸泡30min吸去多余水分后待用）800c干烤1-3h,固化DNA后待用。,1.取1 ug,模板DNA补水总体积16ul，1000C，10min，快速置冰浴2.混匀Dig-Prime(1#)混合液，加4ul到变性模板中，短暂离心，370C，1hour3.加0.2MEDTA pH 8.0 2 ul终止反应（可得到850ng新合成带dig-dUTP的探针DNA）,二.探针标记,三.杂交,预热预杂交液至420C，（10ml/cm2）将已固化DNA的NC膜放入杂交袋中，加入预杂交液，封口，420C水浴1-3小时（不时摇动）(封闭其它位点)。变性dig标记探针：煮沸5min，快速置冰浴。（32ng/ml）将变性探针加入加入杂交液中（3.5ml/100cm2）混匀。剪开杂交袋，弃去预杂交液，加入杂交液，（含变性dig标记探针）去尽泡，重新封口。420C，4-16hr,漂洗杂交后的NC膜，漂洗2次，5分钟，用2SSC 0.1%SDS 室温，不断振荡漂洗2次，15分钟，680C，用0.5SSC 0.1/%SDS（预热）不断振摇。用免疫检测漂洗液洗膜1-5分钟加入适量封闭液，室温30分钟。加入适量抗体溶液，30分钟用免疫检测漂洗液洗膜2次，15分钟用碱性磷酸梅反应液平衡2-5分钟在滤纸中加入适量显色液，将NC膜放在滤纸上（中间不留气泡），暗出显色，30分钟至16小时,四、免疫检测,试剂用途：,1.10 xSSC：DNA结合与硝酸纤维素滤膜的作用取决于转移缓冲液的离子强度。DNA片段越小，使其有效的保留在硝酸纤维素滤膜上所需要的离子强度越高。当DNA500bp时需要20 xSSC。2预杂交液：封闭探针在滤膜表面上的非特异性结合，包括Denhardt试剂、肝素及脱脂奶粉，往往与经变性并经断裂成片段的鮭精DNA或酵母DNA以及SDS一类去污剂一起使用。可使背景杂交得到完全抑制。,重组DNA技术操作的主要步骤,