《组化抗原抗体》PPT课件.ppt

免疫组织化学技术,(immunohistochemistry technique)IHCT,医学技术与工程学院检验系 陈敏,免疫组织化学是根据抗原与抗体特异性结合的原理，以细胞中特异成分为抗原，用标记的抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原及其抗体进行定性、定位、定量测定的一种免疫检测技术方法。,基本原理：抗原抗体反应,标记化学反应,呈色化学反应,概 述,与IHCT相关的免疫学基础：抗原：能刺激机体引起抗体的产生，并与相应抗体发生特异性结合的物质抗体原。抗体：针对某种抗原而产生的，并能识别相应抗原，与其发生特异性结合,第一节 抗原 1.概念 凡能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答；并能与相应的在体内或体外发生特异性结合的物质称为抗原（Antigen，Ag）。,刺激机体免疫系统,特异性反应,特异性反应,抗原（图示）,上页,抗原主要具有两方面的特性，抗原能引起机体产生抗体（和/或致敏淋巴细胞），称之为免疫原性；抗原还与相应的抗体（及致敏淋巴细胞）发生特异性结合或反应，称为免疫反应性。,Fujian Blood Center,http:/rg/,2.抗原的化学结构 一个天然抗原具有二种结构，一是高分子的载体（免疫原性）二是抗原决定簇（特异性）,3.抗原的性质 异物性、大分子、特异性为抗原的共同性质，凡种系越远、分子量越大、构型越复杂、抗原决定簇暴露越多，则其抗原性越强，特异性越高。,抗原的免疫原性,（一）异物性,（二）理化特性 1.分子量 2.化学组成和结构 3.物理性状,下页,异物性,返回,概念：指该抗原与自身正常组织成分的差异 程度。,异物性分类 异种物质,同种异体物质,自身物质,完,理化特性 1.抗原的分子大小,分子量越大，免疫原性越强：1.表面的抗原决定簇多，对淋巴 细胞的活化作用强。2.大分子物质溶于水中呈胶体状，化学结构较稳定，不易被机体破坏或排除，体内存留时间长。,2.化学组成和结构 复杂 蛋白质：大分子，免疫原性强。多糖：细菌荚膜多糖有免疫原性。核酸：免疫原性弱 核蛋白：有免疫原性。类脂：无免疫原性,2.抗原分子的化学组成和结构,氨基酸残基的位置和间距与免疫原性关系,3.物理性状*含芳香族氨基酸较多的蛋白质，免疫原性强，反之则较弱*聚合体蛋白质分子：免疫原性强*单体可溶性蛋白质分子：免疫原性弱,说明：抗原物质化学成分和结构越复 杂，其免疫原性就强。,抗原的特异性 1.即专一性能；2.是免疫应答的基本特点；3.是免疫学诊断与防治的理论依据；,免疫反应特异性的物质基础-抗原决定簇(antigenic determinant)或表位(epitope)：是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。,大多数蛋白质抗原可有多个抗原决定簇,但由于空间位阻作用,在同一时间内仅有部分抗原决定簇暴露和相应的抗体结合。,抗原结合价：一个抗原分子上能与相应抗体 分子结合的抗原决定簇总数。,共同抗原表位与交叉反应,*共同抗原（common antigen):两种不同抗原具有相同或相似的抗原决定簇，互称共同抗原。,*交叉反应：由共同抗原决定簇刺激机体产生 的抗体可以和两种共同抗原结合发生反应。,天然抗原有多个抗原决定簇，故为多价抗原。,半抗原仅有一个抗原决定簇，故为单价抗原。,抗原的类型繁多，分类方法也很多，故抗原的名称各种各样。根据溶解性抗原有可溶和不溶性两类。,抗原的种类,返回,第二节 抗体 1.抗体的概念 抗体（antibody）是机体受抗原刺激后通过体液免疫应答，由B淋巴细胞活化、增殖、分化的浆细胞合成并分泌的，能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。,有关概念,免疫球蛋白:是浆细胞产生的球蛋白。、抗体（antibodies,Ab）：是机体免疫细胞受抗原物质刺激后产生的，能与相应抗原特异性结合，并具有多种免疫学、生物学活性的球蛋白。2、免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig）：指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。,抗体是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都具有抗体活性。抗体是生物学和功能上的命名，而Ig是结构和化学本质上的概念。,免疫球蛋白的基本结构(一)重链（heavy chain，H）2条 轻链（light chain，L）2条(二)可变区（variable region,V区）恒定区（constant region,C区）(三)铰链区（hinge region）(四)结构域,Ig单体的基本结构是由二条相同的轻链和二条相同的重链组成，各自链间（轻重或重重链）由二硫键（SS）相连接，呈Y字构型（图解）,Ig分子的氨基酸构型可分为可变区（N-端）和恒定区（C-端）两部份。,基本结构,基本结构,可变区（variable regions,V区）位于免疫球蛋白多肽链的N端，占轻链的1/2与重链的1/4。该区的氨基酸组成及排列顺序随抗体特异性不同而发生变化。它赋予抗体以特异性。,恒定区（constant regions,C区）位于免疫球蛋白多肽链的N端，占轻链的1/2与重链的3/4。其氨基酸组成及排列顺序都比较恒定。,抗体的基本结构 人类Ig有五类，即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，是由其分子结构中相应的重链（H链）、决定的。重链不同，Ig的类型就不同。,抗体的特性 Ig都是大分子蛋白质，既具有免疫原性，又具有能与相应抗原结合的抗体活性。,免疫原性的类属特异性是由Ig分子的重链和轻链恒定区特定的氨基酸序列所决定。抗体特异性结合抗原的活性位点存在于Ig的可变区。,Ig由B淋巴细胞衍生的浆细胞生成，主要以可溶性蛋白的形式存在于体液中。Ig的主要生物学功能有：特异性结合抗原；活化补体；结合Fc受体等。一个（IgG）抗体分子具有两个抗原结合位点（两价）。,血清型,同种异型 同一物种不同个体间的Ig分子所具有(allotype)特异性不同的抗原决定簇，遗传标志。,Ig具有与Ag特异性结合的特性，又有免疫原性。,同种型 同一物种所有个体间的Ig分子所共有(isotype)的抗原特异性。,独特型 不同B细胞产生的Ig分子V区所具有(idiotype)抗原特异性标志,免疫球蛋白水解片段 1.木瓜蛋白酶（Papain）IgG Fab段(fragment of antigen-binding,抗原结合 片段)Fc段（fragment crystalizable,可结晶片段）2.胃蛋白酶（Pepsin）IgG F(ab)2 pFc 3.意义：阐明Ig分子生物学作用；构建基因工程抗体。,酶水解免疫球蛋白示意图,Fab段(fragment antigen binding),F(ab)2段：大片段，功能同Fab段,木瓜蛋白酶（papain),胃蛋白酶(pepsin),Fc段(fragment crystallizable),pFc：小分子多肽碎片，无生物学活性,抗体的种类依来源分免疫抗体；天然抗体；自身抗体。依反应分完全抗体；不完全抗体。依制备方法分 多克隆抗体；单克隆抗体；基因工程抗体。,抗体是免疫组织化学技术的最关键试剂与 示踪工具。按制备方法分类：1、多克隆抗体(polyclonal antibody,PcAb)2、单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)3、基因工程抗体(genetic engineering antibody)。,1、多克隆抗体：是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清。特异性低，会产生抗体的交叉反应。,2、单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的针对单一抗原决定簇的抗体。特异性强、抗体产量高。,McAb and PcAb,3、基因工程抗体又称重组抗体 是指应用NDA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。,抗体的类型,技术应用类型：1、特异性抗体（一级抗体）2、抗抗体（二级抗体）3、标记抗体,抗体的购置及注意事项 1.抗体的购置 目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。,2.购置抗体的注意事项(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体(2)能否用于石蜡切片(3)稀释度(4)特异性，交叉反应(5)用何种组织前处理形式(6)包装单位，价格,第三节 抗原抗体反应 抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。,基本原理,抗原抗体反应原理,Ag决定簇和Ab分子超变区相互 作用(具有互补性与亲和性)分子表面特异的可逆的弱结合力在极短距离内才能发生,基本条件：结合力亲和性亲水胶体转化为疏水胶体,抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合不形成牢固的共价键，通过非共价键结合这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力,一、抗原抗体结合力,一、抗原抗体结合力,*1静电引力*2范德华引力*3氢键结合力*4疏水作用力,抗原抗体结合力示意图,抗原,抗体,氢键结合力,ON,ON,HH,静电引力,-,+,范得华力,-+,+-,+-,-+,疏水作用力,排斥的水,抗原抗体反应的特点,*1.特异性*2.比例性*3.可逆性,特异性（specificity）,*概念：某种抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结合而起反应的专一性能。,*决定因素：由抗原决定簇和抗体分子超变区之 间空间结构的互补性决定的。,*交叉反应(cross reaction)两种不同的抗原 物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗体反应。,特异性示意图,*最适比(optimal ratio)或等价点(equivzlence point)最迅速出现沉淀时的抗原抗体的浓度 比或量比。,比例性（proportionality）,等价带(zone of equivalence)抗原与抗体分子比例合适的范围。,带现象：Ag与Ab比例不适而不出现可见反应。*前带(prezone)抗体过量时。*后带(postzone)抗原过量时。,比例性示意图,抗体过量,比例合适,抗原的量,抗原过量,免疫复合物沉淀的量,前带,等价带,后带,可逆性（reversibility),概念：是指抗原与抗体结合成复合物后，在 一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。,后抗原抗体仍保持原有特性。解离条件：低pH、高浓度盐等。常用于解离抗原抗体复合物的物质有：3mol/L硫氰化钾、pH2.4 0.1mol/L甘氨酸、7mol/L尿素等。,抗原抗体反应影响因素,一、反应物自身因素*抗原：1.理化特性 2.Ag决定簇数量 3.Ag决定簇种类*抗体：1.来源 2.特异性与亲和力 3.浓度,二、环境条件：*电解质：0.85%NaCl*酸碱度：pH69*温度：1540,受体(receptor)受体在细胞生物学中是一个很泛的概念,意指任何能够同激素、神经递质、药物或细胞内的信号分子结合并能引起细胞功能变化的生物大分子,存在于细胞膜、胞浆或细胞核内。不同的受体有特异的结构和构型。,受体与配体结合的特异性是受体的最基本特点，保证了信号传导的正确性。配体和受体的结合是一种分子识别过程，它依靠氢键、离子键与范德华力的作用使两者结合，配体和受体分子空间结构的互补性是特异性结合的主要因素。,考查题：,根据课题写出应用免疫组化技术部分实验计划（2000字）。,具体内容包括：1-5部分1、题目：应突出实验目的和对象（20字）。2、前言：简要介绍研究的背景资料，提出需要解决的问题，说明实验目的和技术路线，在宏观上阐述免疫组化技术部分的设计方案。,3、材料与方法：重点说明实验对象，标本来源，选用何种免疫染色方法，抗体及标记物的类型，对照的设计等。4、结果和讨论：对实验可能出现的结果进行预测并进行相关分析和讨论，阐述需要解决的关键问题等。5、参考文献：具体列出文中引用的文献，包括作者、题目及出处。,要求：重点说明免疫组化技术部分的设计方案和技术流程，包括一抗的类型、来源、标记物的类型、选择哪一种免疫染色方法，采取何种对照等。阐述需要解决的关键问题和可能出现的结果，并对实验的可行性进行分析。,