《气孔信号转导》PPT课件.ppt

第二章气孔保卫细胞信号转导研究进展,气孔保卫细胞信号转导研究进展,第一节气孔的结构特点及气孔保卫细胞信号 转导的研究意义第二节保卫细胞碳代谢与气孔运动 第三节气孔保卫细胞信号转导,第一节 气孔的结构特点及气孔保卫细胞信号转导的研究意义,研究思路实验设计结果分析,一、研究意义,气孔是植物与环境间进行水分和气体交换的门户，是植物供食防渴的重要通道。组成气孔的保卫细胞对环境条件非常敏感，可以通过水分的出入来调节气孔孔径大小，进而调控植物的蒸腾作用和光合作用等重要生理过程。,保卫细胞有其独特的结构,它与高等植物的其它大多数细胞不同,成熟的保卫细胞缺乏具有生理功能的胞间连丝,因而与其周围的细胞是分离的,这种分离便于对单个细胞直接进行测定;保卫细胞能对多种刺激如光(红光和蓝光)、空气湿度、脱落酸(ABA)、生长素等迅速作出反应,这些刺激可迅速改变离子的运输,引起无机渗透势的变化,并且同时发生保卫细胞体积的改变。,气孔保卫细胞作为研究植物细胞 信号转导的模式系统,3.许多植物的表皮易被撕下，用表皮组织可直接观察。4.荧光指示剂法测定胞内Ca2+浓度和pH及膜片钳技术测定单通道电流成功地运用到保卫细胞中，推动了气孔运动信号转导途径的研究进程。,气孔的结构和其运动机理,保卫细胞的细胞壁是否一个重要的离子贮存库？外壁胞质连丝存在的普遍性和生理作用；质膜上存在哪些激素或其它信号的结合蛋白（受体？）及其和气孔敏感性的关系；保卫细胞质膜和液泡膜上的各种离子通道及其和气孔运动的关系；细胞骨架在气孔运动中的重要作用；叶绿体和线粒体对气孔运动的主要贡献是什么？液泡和细胞核动态变化的功能意义?,气孔启闭运动机理的几个研究热点,调控气孔运动的信号分子：细胞骨架、CaM、CDPK；ABA、H2O2、乙酰胆碱、茉莉酸（JA）、一氧化氮（NO）、MAPK 等 Aquaporin、Expansin对气孔运动的调控机理,二、气孔的结构特点,1.气孔的分布与基本结构2.保卫细胞壁的特化和气孔运动3.质膜 plasma membrane4.叶绿体 chloroplast5.线粒体 mitochondra6.细胞骨架微管和微丝 7.核 nucleus8.液泡,特点,气孔数目多，分布广。气孔数目，大小，分布因植物种类和生长环境而异。气孔的面积小，蒸腾速率遵循小孔律。保卫细胞的体积小，膨压变化迅速。保卫细胞具有多种细胞器，特别是含有叶绿体，对气孔开闭有重要作用。保卫细胞具有不均匀加厚的细胞壁及微纤丝结构。保卫细胞与周围细胞联系紧密，便于物质及水分的交流,1.气孔的分布、种类与基本结构,1.1 分布：气孔普遍存在于植物的叶片表皮上，有些植物的花瓣，萼片，以及苹果、葡萄等发育的果实表面以及马铃薯块茎中都有气孔存在。,1.2 气孔的基本结构,一般由成对的保卫细胞（guard cell）组成,保卫细胞与邻近细胞或副卫细胞构成气孔复合体,气孔的基本结构,1.3 气孔的种类,肾形：大多数双子叶植物和许多单子叶植物、裸子植物、蕨类和藓类的保卫细胞。,哑铃形：禾本科植物和几种苔草Cyperaceae(莎草科)的保卫细胞。,1.4 保卫细胞和叶肉细胞的某些结构比较,a,Pearson和 Mithorpe,1974 b,Allaway 和Setterfield,1972 c,Outlaw等，1980,2.保卫细胞壁的特化和气孔运动,内侧壁（inner lateral wall）：靠气孔下腔的壁。,背壁（dorsal wall）：指和表皮细胞相邻的壁。,腹壁（ventral wall）：和背壁相对、近孔处的壁。,外侧壁（outer lateral wall）：靠叶片外表面的壁。,保卫细胞壁的特化和气孔运动,保卫细胞的壁各处厚薄不均：肾形保卫细胞一般背壁薄而腹壁特别加厚；哑铃形保卫细胞的球状末端壁较薄而中间棒状部分壁厚。保卫细胞的壁有相当的弹性：壁的特异加厚和纤维素微纤丝的定向是保卫细胞不均匀膨胀和气孔运动中形状改变的主要决定因素。,气孔的保卫细胞纤维素的基本排布,肾形保卫细胞纤维素微纤丝从孔向周围呈辐射状定向，哑铃形保卫细胞球状部分纤维素微纤丝从孔向外放射。,气孔运动最根本的结构基础是保卫细胞壁中径向排列的微纤丝。,2.1 果胶质：,保卫细胞壁富含的胼胝质、木质素等带负电的多聚物分子有很强的吸附阳离子的能力，是一个离子暂时贮存的库，对气孔运动中大量离子出入保卫细胞，特别是对K的快速转运有重要意义。,2.2 壁角质层（cuticle）,通常在外侧壁厚，有阻止水分丢失的功能，水蒸气通过角质层的扩散速率一般很低。,2.3 胞间连丝和外壁胞质连丝（plasmodesmata and ectadesmata）,在保卫细胞发育过程中，和相邻表皮细胞间存在胞间连丝，是同化物和离子交换的通道，外源的糖可能通过胞间连丝运入保卫细胞，保卫细胞可利用外源的糖在自己的叶绿体中合成淀粉后贮存。在成熟的保卫细胞与相邻表皮细胞间没有胞间连丝存在。,外壁胞质连丝是从保卫细胞原生质延伸出来的细胞质指状物。外连丝可能是叶片吸收、离子运输、角质层沉积或围孔蒸腾场所，也有认为只是一种赝象,3.质膜,保卫细胞质膜上的结合蛋白保卫细胞质膜上的离子通道（ion channel）水通道蛋白,保卫细胞PMH+-ATPase,3.1保卫细胞质膜上的结合蛋白,3.1.1 脱落酸受体（结合蛋白）,保卫细胞质膜外侧和细胞内存在ABA高亲和力的结合蛋白，ABA和其受体蛋白或结合位点结合后，经一系列信号转导途径，引起渗透势变化。,不同的植物种类、器官和细胞类型可能存在不同的ABA结合蛋白，它们分别行使不同的功能。,ABA 在保卫细胞上不仅有胞外作用位点,也有胞内作用位点,胞外pH的变化会对ABA 的存在形式产生影响。,在pH6.5 下外用ABA,气孔开度被抑制达98%,这提示ABA 对气孔的影响需胞外位点的参与。在pH8.0 下鸭跖草保卫细胞外用ABA,只有57%的气孔开度受抑制。向保卫细胞里注射ABA 则会使之关闭。,ABA受体,The flowering-time control protein FCAThe Mg-chelatase H subunit ABARthe G proteincoupled receptor GCR2,ABA受体,FCA:F.A.Razem et al.,Nature 439(2006),pp.290294 ABAR:Y.Y.Shen et al.,Nature 443(2006),pp.823826 GCR2:X.Liu et al.,Science 315(2007),pp.17121716,3.1.2 乙酰胆碱受体,荧光定位和免疫印迹鉴定表明,保卫细胞原生质体质膜上存在乙酰胆碱受体，受体激活剂和抑制剂的药理学实验证明其乙酰胆碱受体参与乙酰胆碱调控的气孔运动。,M型乙酰胆碱受体 BODIPY FL ABT标记,3.1.3 GTP 结合蛋白,编码小GTP 蛋白的rha1基因,主要在拟南芥和烟草叶片气孔保卫细胞发育过程中表达（Terryn等,1993），据报道可能不止一种G蛋白参与气孔运动调控中的保卫细胞信号转导。,3.1.4 光受体,光诱导气孔张开，蓝光可促进H分泌并诱导保卫细胞原生质体膨胀。,在保卫细胞中可能有两种或两种以上光受体，一种对蓝光作出反应，另一种对UVA 作出反应。其中一个是叶绿体中的类胡萝卜素，另一个可能是质膜上的黄素蛋白。,3.2保卫细胞质膜上的离子通道（ion channel）,3.1保卫细胞质膜上的结合蛋白,3.2.1 内向、外向K通道,3.2.2 质膜上的阴离子通道（anion channel）,3.2.3 钙离子通道,气孔保卫细胞上的离子通道,气孔保卫细胞上的通道或载体,3.2.1 内向、外向K通道,内外K+通道都可被Ba2+阻断，内向K+通道可被Al3所阻断。外源Ca2+直接抑制内向K+通道，胞质Ca2+也能抑制内向K+通道。外向K+通道对Ca2+、G蛋白调节剂PTX和CTX及IP3都不敏感，但对胞内pH非常敏感，在胞质pH较高时被激活，而胞质酸化时受抑制。,质膜上的阴离子通道（anion channel）,在保卫细胞质膜上存在三种阴离子通道,R型（Rapid type）阴离子通道,S型（Slow type）阴离子通道,SA（Stretch-activited）离子通道,可能参与调控气孔张开,可能在调控气孔关闭需要持续的阴离子外流中起作用,是对膨压高度敏感的非专一性Ca2+通道，同时可以通透Cl和K，被认为对保卫细胞的渗透调节十分重要,3.2.3 钙离子通道.,胞内Ca 2+升高可能激活依赖Ca 2+-CaM复合物的蛋白激酶(CDPK)的活性；胞内Ca 2+浓度变化也可能直接影响K+通道的活性;胞内Ca 2+积累还可调节阴离子跨膜流出或刺激液泡内K+的释放;胞内Ca 2+水平的升高还可能抑制PM H+ATPase 的活性,引起质膜去极化,从而调节气孔运动.,气孔保卫细胞上的钙离子通道,3.3 水通道蛋白,70年代初，首先在动物中发现，水通道蛋白（aquaporin,AQP or water channel）或水孔。92年鉴别出第一个水通道蛋白，证实由它介导水的跨膜转运。95年发现拟南芥保卫细胞质膜上、97年发现向日葵保卫细胞的液泡膜上都存在AQP。,水孔蛋白(Aquaporin),或称水通道(Water channel)蛋白的特点：,存在于细胞膜上专一运输水的内在性蛋白；细胞通过膜上水孔蛋白开关及含量变化来调节水跨膜运输；独立于离子通道和离子泵。,AQP1结构（四聚体）,分子量为2530KDa、选择性、高效转运水分子的膜水通道蛋白称为水通道蛋白或水孔蛋白（aquaporins)。,AQP1结构,膜内在蛋白，由5 个短环(loop)相连的6 个跨膜2螺旋及伸入细胞质的N 端和C 端组成,植物体内主要存在三种类型水孔蛋白：,1.质膜水孔蛋白。,2.液泡膜水孔蛋白。,3.和大豆根瘤菌周膜上水通道蛋白NOD26类似的通道蛋白NLMS(NOD26-like-MIPs)。,3.4 保卫细胞PM H+-ATPase,PM H+-ATPase 激活，膜超极化，气孔张开；反之,气孔关闭。,功能主要表现：,(1)产生质子驱动力即跨膜电化学势梯度pH 驱动了K+、Cl-等的次生跨膜转运;(2)调节胞质内pH,质子泵活动使GC释放质子,胞内pH升高,酶活性提高,溶质浓度增加,气孔开放。,H-ATPase 参与了生长素刺激气孔开放的过程.,用膜片钳技术检测GC 原生质体,发现5mol L-1 2,4-D 可增加质子泵产生的外流电流,这种电流出现需要胞内ATP 的存在,且PM H+-ATPase 的抑制剂双环碳化二亚胺可使之消失。,光、激素、环境因子都可激活或抑制GC 质子泵的活性.,H+-ATPase的专一抑制剂钒酸盐可抑制蓝光效应,；红光驱动的叶绿素反应,也可激活质膜上的质子泵.,二、气孔的结构特点,1.气孔的分布与基本结构2.保卫细胞壁的特化和气孔运动3.质膜 plasmalemma plasma membrane4.叶绿体 chloroplast5.线粒体 mitochondra6.细胞骨架微管和微丝 7.核 nucleus8.液泡,4.叶绿体 chloroplast,多数植物的每个保卫细胞中有1015个叶绿体,叶肉细胞中的叶绿体数量在几十个到100个之间。叶绿体内含大量淀粉粒，而且淀粉含量有昼夜的变化，白天气孔张开时，淀粉含量下降，夜间气孔关闭，淀粉积累。淀粉降解为合成有机阴离子提供碳骨架,参与渗透势调节。,表2 蚕豆保卫细胞和叶肉细胞叶绿体比较,与叶肉细胞相比，多数植物保卫细胞的叶绿体发育不好，类囊体结构小，基粒少。,5.线粒体 mitochondra,保卫细胞含大量线粒体，通常是叶肉细胞的两倍，其大小、形状和嵴无太大差别。相对于叶肉细胞，保卫细胞的呼吸速率也高得多。气孔的开放和关闭都是主动耗能的过程，由于叶绿体发育不完善，气孔运动所需能量主要来源于氧化磷酸化形成的ATP。,6.细胞骨架微管(microtubule,MT)和微丝(microfilament,MF),在保卫细胞发育和分化中起重要作用：微管决定了保卫细胞壁纤维素微纤丝的走向，使保卫细胞膨胀时，只能向背壁突出而拉开中间的孔。,微管和微丝可能参与调节气孔运动,用植物微丝专一性抑制剂细胞松弛素D（CD）和微管特异性解聚剂甲基胺草磷(APM)预处理蚕豆表皮，可明显抑制Ca2+，ABA，光，K+引起的气孔运动。,微丝骨架的标记,成熟的保卫细胞壁特别加厚,标记微丝骨架的探针很难进入胞内,因此保卫细胞微丝的标记问题成为研究微丝骨架调控气孔运动机理的障碍。通过游离保卫细胞原生质体来标记微丝骨架。但原生质体与正常生理状态的保卫细胞相比,细胞形状发生了很大的变化,而且被标记的微丝数量少。,成熟的标记保卫细胞微丝骨架的方法显微注射；冰冻撕裂后的间接免疫荧光标记；借助于转基因技术在植物体内表达GFP-mTn 融合蛋白,A 显微注射：利用微量进样器借助于压力,将探针注入活的保卫细胞(Kim et al,1995)。通过显微注射可记录单个保卫细胞在各种信号刺激和不同气孔孔径状态下微丝骨架的分布,它是研究保卫细胞微丝骨架的一种重要方法。,保卫细胞中的细胞骨架,1 3:from open to close5 7:from close to open,（1)Hypothesis for MT dynamics involved in stomatal movement,a.in the open stoma the transversal cortical MTs are oriented and pass between the ventral wall and the dorsal wall.b.in closing stoma MTs are twisted and patched.c.in closed stoma,the diffused MTs appear d.when the closed stoma was opened by light,the reverse pattern is:the diffused MTs are reoganized to the transitional pattern,then to the polymerized pattern,（2)Distribution of actin cytoskeleton in guard cells of Transgenic Arabidopsis,opened,closed,closing,polymerizedpattern,polymerizedpattern,depolymerizingpattern,Simply model for actin dynamics in stomatal movement,Opened stoma,Closed stoma,Steady-state,Changing-state,Actin filaments polymerized,Actin filaments depolymerizing,Actin filaments polymerized,Steady-state,显微注射标记的气孔保卫细胞中的微丝,细胞松弛素D(CD)能完全解聚微丝骨架CD处理30分钟后保卫细胞中微丝解聚成短片断,鬼笔环肽(phalliodin)能促进微丝骨架聚合,开放的稳态气孔保卫细胞中微丝的分布,微丝排列紧靠质膜，由腹壁向背壁呈放射装排列。在质膜至细胞核的保卫细胞区域内，没有微丝的分布。但细胞核染色较深，细胞核四周由微丝环绕，并且较粗的微丝束从核的四周向伸出。,半开放的稳态气孔保卫细胞中微丝的分布,周质微丝同样呈放射状由腹壁向背壁排列。在质膜至核的细胞区域内，没有微丝的分布。细胞核染色很深，少量微丝由细胞核向四周伸出。在靠近内壁的周质区域可见明显的微丝,关闭的稳态气孔保卫细胞中微丝的分布,散乱分布在整个周质区域。与开放气孔相比，其分布区域更靠近细胞质。细胞核染色较深，在核平面上观察不到微丝。,光诱导开放的气孔保卫细胞中微丝的动态变化,光诱导30 分钟后，保卫细胞微丝不再呈放射状分布，而是呈短片断随机分布并靠近外壁。,光诱导开放的气孔保卫细胞中微丝的动态变化,光照处理60分钟后，保卫细胞中已观察不到丝状微丝，保卫细胞中微丝完全解聚。,光照处理150分钟后，气孔开度不再变化，保卫细胞中观察到了放射状分布的微丝。说明光照150分钟后，保卫细胞中肌动蛋白重新聚合成微丝。,ABA诱导气孔关闭过程中保卫细胞中微丝的动态变化,ABA处理5分钟后，微丝开始解聚,ABA处理30分钟后，ABA处理30分钟后，气孔关闭，此时保卫细胞中完全观察不到微丝,ABA处理120分钟后，气孔开度不再变化，保卫细胞中观察到少量随机分布的微丝，微丝斜向由腹壁伸向背壁，说明肌动蛋白开始重新聚合成微丝。,B.标记保卫细胞微丝骨架的方法冰冻撕裂后的间接免疫荧光标记,这是标记完整表皮上保卫细胞微丝骨架的一种方法。为了利于探针通过细胞壁,通过冰冻撕裂,借助于机械力破坏细胞壁,然后再进行标记微丝骨架探针的孵育。优点：一次可以标记大量的保卫细胞,同时观测多个保卫细胞微丝骨架的分布,有利于得到统计学上的实验结果。缺点：在固定过程中,气孔孔径会发生变化,这样可能会影响微丝骨架的结构。,间接免疫荧光标记常用的探针,鬼笔环肽(phalloidin)和肌动蛋白(actin)的抗体。,phalloidin 是一种低分子量的真菌代谢物,它极易通过膜并且易与聚合态的微丝结合。与phalloidion 结合的荧光染料中,有FITC、Rho2 damine 及Alex 等,C.标记保卫细胞微丝骨架的方法借助于转基因技术在植物体内表达GFP-mTn 融合蛋白,鼠的tallin 蛋白的C 端含有多个可与微丝骨架结合的氨基酸。同时与tallin 蛋白C 端的结合不会影响微丝骨架的性质。所以这种融合蛋白是近年活体标记保卫细胞微丝骨架的理想探针。这种转基因技术尤其适于拟南芥等易于转化的植物。,利用GFP-mTn 蛋白与微丝骨架的结合来记录不同气孔孔径下活的保卫细胞微丝骨架的分布,这大大提高了实验结果的可信性。,CD对光诱导的气孔开放的影响。,a.分别在光照处理0、30、60、90分钟后观察记录气孔开度。b.在暗中于含20m CD的表皮条缓冲液预处理30分钟后，转移到光下，分别在光照处理0、30、60、90分钟后观察记录气孔开度,CD预处理促进了光诱导的气孔开放,鬼笔环肽对光诱导气孔开放的影响,微丝稳定剂鬼笔环肽处理抑制了光诱导的气孔开放,a.暗诱导的关闭气孔。b.关闭气孔转移至表皮条缓冲液中光照60分钟后气孔的开度。c.关闭气孔在含0.1mM鬼笔环肽的表皮条缓冲液中预处理30分钟，再转移至光照处理60分钟后气孔的开度。,CD对K+诱导的气孔开放的影响,暗诱导的关闭气孔。暗诱导关闭的气孔在含50mMKCl的表皮条缓冲液中光照处理60分钟后的气孔开度。暗诱导关闭的气孔在含20M CD 的表皮条缓冲液中光照处理60分钟后的气孔开度,CD促进了K+诱导的气孔开放,鬼笔环肽对K+诱导的气孔开放的影响,a.暗诱导的关闭气孔。b.暗诱导关闭的气孔在含0.1mM 鬼笔环肽的表皮条缓冲液中预处理30分钟，转移至光照下60分钟后的气孔开度。c.暗诱导关闭的气孔在含50mMKCl的表皮条缓冲液中光照处理60分钟后的气孔开度。,鬼笔环肽抑制了K+诱导的气孔开放,微丝的动态变化调控了内向K+通道的活性,光诱导开放的气孔中，微丝解聚剂 CD诱导的微丝解聚激活了内向K+通道的活性，增强了保卫细胞的膨压，从而促进光诱导的气孔开放。推测微丝解聚可能影响了多种酶的活性，从而激活了内向K+通道的活性。,微丝参与了气孔保卫细胞中，小泡与质膜的融合,微丝还参与了保卫细胞中液泡的动态变化。,在开放的气孔保卫细胞中，液泡大而数量少；在关闭的气孔中，液泡小而数量多。,用CD处理保卫细胞，发现小液泡融合成大液泡。推测由微丝组成的网络结构决定了液泡的位置，并对液泡的分割和融合有重要作用，从而对气孔运动产生影响。,CD对ABA诱导气孔关闭的影响,a.光诱导的开放气孔。b.开放气孔经20M CD预处理30分钟后，加入10M ABA 处理5分钟后的气孔开度。c.开放气孔直接加ABA 5分钟后的气孔开度。d.处理b经过60分钟后的气孔开度。e.处理c经过60分钟后的气孔开度。,CD预处理加速了ABA诱导的气孔关闭。,鬼笔环肽对ABA诱导气孔关闭对影响,a.光诱导开放的气孔。b.开放气孔经0.1mM鬼笔环肽预处理30分钟后,加入10M处理60分钟后的气孔开度。c.开放气孔未经鬼笔环肽预处理直接加入10M ABA处理60分钟后的气孔开度。,鬼笔环肽抑制了ABA诱导的气孔关闭,Possible model for Action of Both Water Channel and Cytoskeleton in Stomatal Movement,Dynamics of Cytoskeleton,Water Channel,Transporting Rate of Water Across Membrane,Stomatal Open or Close,No K+,Stimuli(light,ABA,dark,FC,IAA,CaM),Second Message,K+Channel,Ca+Channel,微丝骨架参与气孔运动调控的可能机制,保卫细胞微丝骨架的上游信号组分,保卫细胞微丝骨架调控的下游信号组分,Ca 2+cyt,蛋白激酶和蛋白磷酸酶,AtRac1 蛋白,微丝结合蛋白,离子通道,水孔蛋白,微丝骨架参与气孔运动调控的可能机制保卫细胞微丝骨架的上游信号组分,Ca 2+cyt,胞质中的游离Ca 2+可能是保卫细胞微丝骨架动态变化的一个重要调节因子。,2 mmol/L CaCl 2 可诱导鸭跖草保卫细胞微丝骨架的解聚,Ca 2+诱导微丝骨架的解聚与ABA 的作用相似。当用5 mmol/L EGTA 去除游离Ca 2+后,ABA 诱导的保卫细胞微丝骨架的解聚明显地被抑制,去除EGTA 后,ABA 诱导微丝骨架的解聚又得到恢复。,微丝骨架参与气孔运动调控的可能机制保卫细胞微丝骨架的上游信号组分,蛋白激酶和蛋白磷酸酶,蛋白激酶和蛋白磷酸酶抑制剂都能影响开放的气孔保卫细胞微丝骨架的分布,也能抑制ABA 和Ca 2+诱导的保卫细胞微丝骨架的解聚。,微丝骨架参与气孔运动调控的可能机制保卫细胞微丝骨架的上游信号组分,AtRac1 蛋白,AtRac1 是从拟南芥中克隆的与Rho 相关的小鸟苷三磷酸酶(GT2Pase)家族的一个基因,它具有哺乳动物的小GTPase 的保守结构域。AtRac1 在拟南芥的保卫细胞中表达量丰富,是在保卫细胞ABA 信号转导中,微丝骨架上游的一个负调节因子。ABA 的处理可使AtRac1 失活,从而解聚微丝骨架,进而导致气孔关闭。,微丝骨架参与气孔运动调控的可能机制保卫细胞微丝骨架的上游信号组分,微丝结合蛋白,真核细胞微丝骨架聚合和解聚的动态变化是受多种微丝结合蛋白直接调控的。ADF 和PROFILIN 蛋白家族是植物中被分离和定性的两类微丝结合蛋白。ADF 能促进微丝解聚,而PROFILIN 有促进微丝聚合和解聚的双重功能,二、气孔的结构特点,1.气孔的分布与基本结构2.保卫细胞壁的特化和气孔运动3.质膜 plasma membrane-离子通道、受体4.叶绿体 chloroplast5.线粒体 mitochondra-多6.细胞骨架微管和微丝-解聚-聚合7.核 nucleus8.液泡,7.核 nucleus,气孔运动时，保卫细胞的核常改变形状。蚕豆处于黑暗下、气孔关闭时，保卫细胞的核为卵园性，而照光气孔开放时核为园形。,8.液泡,8.1 液泡的动态变化,鸭趾草气孔运动时，保卫细胞液泡的体积从气孔开度为0时的2.5 pl增加至气孔开度为16mm时的6 pl。张开的气孔保卫细胞中有一个或几个较大的液泡，而关闭的气孔保卫细胞中有许多小的液泡.,在保卫细胞中，液泡在积累离子和产生膨压方面具有极其重要的功能。,Vacuoles of guard cells at different stomatal apertures,蚕豆气孔运动过程中，保卫细胞液泡的动态变化,stage 开度小于 5m,stage 5 to 8 m,stage:开度大于8m,Xin-Qi Gao,Chun-Guang Li,Peng-Cheng Wei,Xin-Yan Zhang,Jia Chen,and Xue-Chen Wang：The dynamic changes of tonoplast in guard cells are important for stomatal movement in Vicia faba，2005，Plant Physiology,139(3):1207-1216,FC,ABA,8.2 液泡膜上的离子通道,SV（slow vacuolar）FV（fast vacuolar）通道非电压依赖型的K选择性(VK)通道。,为Ca2+和Mg2+激活，是电压依赖型的，在气孔关闭的调节中，液泡中的Ca2+可能经SV通道释放.,为瞬时的，在正的膜电势时电流较大,在胞质Ca2+升高时VK通道被激活，不依赖于电压，对K有高度选择性，在保卫细胞膜上VK通道的分布密度极大，可能在调控K从液泡向胞质释放中起重要作用.,气孔保卫细胞液泡膜上的离子通道,植物叶片气孔开放/关闭运动渗透调节模式图,质子泵被激活,质膜超极化,胞质内pH的升高,钾离子通道,淀粉磷酸化酶,可溶性糖,PEP羧化酶,苹果酸,钾离子,溶质浓度,水势下降,保卫细胞吸水膨胀,第二节 保卫细胞碳代谢与气孔运动,一.保卫细胞中酶的特点二.保卫细胞的碳代谢三.保卫细胞光合碳代谢气孔运动的能量关系,一.保卫细胞中酶的特点,1.1 保卫细胞叶绿体中的RuBP羧化酶(Rubisco)和PEP羧化酶(PEPC),气孔保卫细胞中存在Rubisco，但是，和叶肉细胞相比，量少而活性较低，如蚕豆叶保卫细胞Rubisco/GC是叶肉细胞含量的0.01%，其活性仅是叶肉细胞的1%。,从快速冰冻干燥的蚕豆叶片上直接解剖保卫细胞，用以提取PEPC进行分析，一对保卫细胞约有3pg PEPC。,1.2 保卫细胞PEPC的特性,蚕豆气孔保卫细胞的PEPC分子量为467 KDa,是含110KDa和 112KDa两种亚基的四聚体。蚕豆保卫细胞PEPC催化反应：PEP+HCO3 OAA+Pi 而后，草酰乙酸（OAA）转化为苹果酸。,a.受一定浓度的苹果酸抑制，而被G-6-P激活,b.和pH密切相关。蚕豆保卫细胞在pH 8.5时，Km（PEPMg）为0.16 0.02,而在pH 7.0时为0.71 0.11,c.用壳梭霉素（FC）刺激蚕豆叶片气孔张开时，保卫细胞的PEPC发生磷酸化被激活，而用ABA诱导气孔关闭时，则PEPC去磷酸化，表明保卫细胞中PEPC的翻译后修饰和气孔运动的调节有关。,1.3 其他主要酶蚕豆叶片保卫细胞和叶肉细胞中某些重要酶活性比较（mmol mg-1protein h-1）,蚕豆叶片保卫细胞和叶肉细胞中某些重要酶活性比较,保卫细胞有显著高的呼吸代谢酶的活性，这为气孔运动的能量需求提供了代谢基础；其次是有较高的苹果酸代谢和糖转化的酶活性，为苹果酸的快速形成和糖的转化所需要。,二.保卫细胞的碳代谢,照光使保卫细胞CO2同化速率增加近2倍，但能使叶肉细胞CO2同化速率增加近50倍。由于保卫细胞PEPC占主导，保卫细胞中的碳代谢主要是形成苹果酸。,2.1 苹果酸的形成和气孔关闭时苹果酸的去向,2.2 蔗糖的作用,2.3 保卫细胞光合碳代谢,保卫细胞的碳代谢,2.1 苹果酸的形成和气孔关闭时苹果酸的去向,气孔关闭时，保卫细胞中的苹果酸下降、淀粉含量增加。气孔张开时，淀粉含量下降，苹果酸含量增加。,淀粉是苹果酸形成上碳架的主要来源。保卫细胞内存在的PEPC和叶肉细胞中的PEPC显然有不同的功能，在保卫细胞中，PEPC的作用是催化苹果酸的形成。,目前的实验表明苹果酸可能有三种去向：,1)从保卫细胞释放到质外体、2)在保卫细胞的线粒体中被代谢3)或在保卫细胞中回到淀粉合成。,2.2 蔗糖的作用,气孔运动是由保卫细胞渗透势的变化来调节的，最早提出的假说就是淀粉和糖的可逆转化，后来发现K是影响保卫细胞渗透势变化的主要物质。,近20年来的研究发现，在照光时，单独K的增加不足以满足保卫细胞渗透势变化的需求，一些证据说明蔗糖确实起着一定的作用：,蔗糖起作用的证据：,首先，14C标记试验证明从叶肉细胞向保卫细胞运输包括蔗糖在内的碳水化合物；其次，Hite等（1993）发现蚕豆保卫细胞中有较高水平的蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶，即保卫细胞中存在活跃的蔗糖的合成和降解代谢；Lu Ping等（1995）的试验揭示，蚕豆叶片气孔开放时，保卫细胞蔗糖含量增加，特别是保卫细胞质外体中的蔗糖含量明显增加，他们提出增加的蔗糖可能作为一种信号代谢物。,蔗糖起作用的证据：,照光引起的气孔开放依赖于K的增加，K的吸收和积累是气孔快速开放的主要调节因素，但保卫细胞中并不长期保持高的K浓度，随K的下降，蔗糖逐渐积累以维持保卫细胞渗透势，而后参与调节气孔的关闭。由此看来，K和蔗糖在不同的时相起作用，参与气孔保卫细胞渗透势的调节。,Talbott和Zeiger（1996）用蚕豆整株植物研究了全天气孔运动过程中，K和蔗糖的动态变化，,2.3 保卫细胞光合碳代谢,保卫细胞叶绿体中几乎不存在此酶或酶活性很低；另一些资料表明在保卫细胞中存在卡尔文循环。目前一般认为，卡尔文循环所能提供的渗透物质仅占2的比例，而所测定到的保卫细胞中的蔗糖大部分可能来源于叶肉细胞合成并运输到保卫细胞。,保卫细胞固定CO2的可能作用：,消耗光合电子传递形成的NADPH；补充淀粉为合成有机阴离子提供C骨架、保卫细胞自养或合成部分渗透物质；光合碳还原途径是一种光感受机制（Preiss,1982），消耗CO2来介入气孔对CO2的敏感性。,三.保卫细胞光合碳代谢气孔运动的能量关系,兴趣点主要集中在气孔运动的能量来源上。气孔的张开和关闭运动都是需能过程,缺氧处理和用代谢抑制剂，如磷酸化作用的解偶联剂、电子流的阻断剂能阻止气孔张开。呼吸抑制剂（叠氮化钠）、低温、缺氧、CCCP（抑制叶绿体和线粒体ATP形成、质膜的超极化）处理能阻止已张开的气孔关闭,气孔运动的能量基础,保卫细胞的呼吸作用、光合作用和兰光敏感型的质膜氧化还原系统。,黑暗下的气孔运动依赖于呼吸作用的氧化磷酸化；光下的气孔运动显然需要光合磷酸化，而且，在某种程度上光下气孔的张开主要依赖于环式光合磷酸化；兰光引起的气孔张开以氧化磷酸化或质膜电子传递体氧化还原形成的质子流为能量来源。,3.1 保卫细胞呼吸作用对能量的贡献,呼吸作用中的氧化磷酸化是气孔运动的主要能量来源,与叶肉细胞相比保卫细胞具有以下特点。,3.1.1 高线粒体活性,3.1.2 细胞色素氧化途径占主导：,两种植物体保卫细胞中线粒体与叶绿体的比较,植物 细胞类型 线粒体数(a)叶绿体数(b)a/b,保卫细胞 50.8 5.3 9.6韭葱 叶肉细胞 16.8 17.8 0.9 蚕豆 保卫细胞 22.6 6.2 3.6 叶肉细胞 11.0 15.2 0.7,3.1.1 高线粒体活性,保卫细胞富含线粒体，保卫细胞原生质体的呼吸速率也很高(280mmol mg-1chl h-1)是叶肉细胞原生质体呼吸速率的几倍,保卫细胞原生质体中三羧酸循环的酶量是叶肉细胞原生质体中的25倍,3.1.2 细胞色素氧化途径占主导：,用细胞色素氧化途径的抑制剂KCN和交替氧化途径的抑制剂水杨基氧污酸(SHAM)证明，保卫细胞线粒体经三羧酸循环产生的NADH通过这两条途径被氧化。但在保卫细胞中交替氧化途径仅占总呼吸的1/3，而在叶肉细胞中交替氧化途径占2/3。,3.2 保卫细胞光合作用的能量贡献,保卫细胞中叶绿体数目少，叶绿素含量低，其类囊体结构简化，但保卫细胞叶绿体存在光合电子传递和光合磷酸化所需的重要组分：PSI、PSII、捕光色素蛋白复合物（LHCP）和叶绿体偶联因子。光合磷酸化是除呼吸作用以外保卫细胞气孔运动的能量来源。,保卫细胞光合作用的主要作用不是进行CO2的固定，保卫细胞光合作用的功能主要是：,光合磷酸化作用、兰光信号转导和向胞质转移还原力,光下CO2固定速率与放O2速率的比率，在叶肉细胞中大约为1，而在保卫细胞中仅为0.4。,证据：,第三节、气孔保卫细胞信号转导,一 信号及信号传递途径 1.保卫细胞膜上的受体（结合蛋白）2.G蛋白 3.保卫的第二信使二 激素对气孔运动的调控 1.ABA 2.IAA与CTK 3.ACh 4.SA与JA,保卫细胞信号转导,一 信号组分及信号传递途径,环境信号：湿度、CO2、光、温度内部信号：激素受体 跨膜信号转换（G蛋白）胞内第二信使（Ca2+、IP3、cAMP等）H+ATPase、离子通道调节 渗透势变化 水分出入 膨压变化 气孔运动。,信号,信号传递途径,1.保卫细胞膜上的受体（结合蛋白）,a.脱落酸结合蛋白（ABA-BP）,蚕豆保卫细胞质膜外侧或胞内存在ABA高亲和力的结合蛋白,每个原生质体上大约有20003000个结合位点。ABA和其受体蛋白或结合位点结合后，经一系列信号转导途径，引起渗透势变化.,证据,在pH6.5条件下外用ABA，气孔开度被抑制98，因而认为ABA结合位点在质膜外侧。在pH8.0 时鸭趾草保卫细胞外用ABA，只有57%的气孔开度受抑制，此时ABA呈离子状态，不易进入细胞，而pH 为6.5 时，ABA 呈分子状态，容易被吸收，气孔开度的程度大，这说明胞内存在着ABA结合位点。,The flowering-time control protein FCAThe Mg-chelatase H subunit ABARthe G proteincoupled receptor GCR2,FCA:F.A.Razem et al.,Nature 439(2006),pp.290294 ABAR:Y.Y.Shen et al.,Nature 443(2006),pp.823826 GCR2:X.Liu et al.,Science 315(2007),pp.17121716,ABA受体,Takashi and Shinozaki:TRENDS in Plant Science 2007,Vol.12 No.8,343-351,Red:demonstrated;black:predicted;blue:predicted cross-talk.,b.乙酰胆碱受体,保卫细胞膜上的受体,荧光定位和免疫印迹鉴定表明,保卫细胞原生质体质膜上存在乙酰胆碱受体，受体激活剂和抑制剂的药理学实验证明其乙酰胆碱受体参与乙酰胆碱调控的气孔运动.,乙酰胆碱,动物的神经递质,在植物中也广泛存在,参与调节气孔的运动。乙酰胆碱可以作为根源负信号物质调控气孔运动,20%PEG处理水培蚕豆苗-半根胁迫Hydroponic plant treated by 20%PEG-split-roots system,张建华,乙酰胆碱参与气孔运动调控的证据,蚕豆根能够合成乙酰胆碱,半根渗透胁迫时(可保持叶片水势不变),经木质部运输的乙酰胆碱减少,叶片下表皮乙酰胆碱含量也明显下降,气孔导度减小。蚕豆叶片下表皮(气孔密布处)乙酰胆碱含量变化和蒸腾作用密切相关。气孔开放需要根系输送的生理活性物质,断根后气孔导度减小,蒸腾下降,但如果去根后加入乙酰胆碱,则气孔孔径增大并恢复到断根前的水平。,乙酰胆碱受体的荧光定位,保卫细胞膜上的受体,自发荧光,BODIP FL ABTB标记,对照,c.光受体,红光与兰光都诱导气孔张开。在保卫细胞中可能有两种或两种以上光受体，对蓝光作出反应-叶绿体中的类胡萝卜素对UVA 作出反应-可能是质膜上的黄素蛋白,d.CO2感受器：,气孔对CO2反应非常灵敏，低浓度CO