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,疑难问题交流,杭州第七中学 生物组 孔彦平,限制性内切酶相关问题,重组DNA分子导入细胞的问题,PCR技术中的一些相关问题,(1)限制性内切酶能够识别和切割单链DNA，例如有些酶能够识别和切割非回文序列，但这种酶在基因工程应用不够广泛,（一）限制性内切酶能否切割单链？,(2)基因工程中的限制性内切酶主要是识别和切割双链DNA，因为大多数限制内切酶是以二聚体的形式与DNA结合，酶与DNA形成稳定的化合物，产生反应，也有部分酶是以单体的形式与DNA结合,（二）限制酶识别序列的方向性,05全国理综限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶的切点。请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？,答案：,可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）。,有人质疑：,此时得到的目的基因与质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端是无法进行碱基配对,这种情况根本不会出现,DNA分子的两条脱氧核苷酸长链是反向平行的，一条链是53方向，另一条是35方向。在一般表示DNA分子碱基序列的图中，上边一条链是53方向，下边一条是35方向。限制性内切酶的识别序列也是有方向性的，通常写出的限制酶的识别序列是专指53那条链上的碱基序列。在上面的例题中，限制性内切酶的识别序列和切点就是5GGATCC3，限制性内切酶的识别序列和切点是5GATC3。所以上图画的序列中，目的基因所在的DNA序列，只有左边具有一个限制性内切酶的识别序列和切点，右边的那个序列是5CTAG3，不能被限制性内切酶识别和切割，因此上述设想的那种情况不会出现。,下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是 ACTTAAG，切点在C和T之间 BCTTAAG，切点在G和A之间CGAATTC，切点在G和A之间 DCTTAAC，切点在C和T之间,C,CaCl2法制备感受态细胞及转化过程：细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，制成感受态，经42短时间热冲击处理能提高转化的效率。,其中的钙离子的作用机理（假说）：,（1）改变了细胞壁的通透性（用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通性）：使细胞壁局部原生质化，增加细胞壁的通透性,（2）改变了细胞膜的通透性,低温的CaCl2溶液中，（1）Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，当42度热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。（2）促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，同时Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上,实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化 实验目的 通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作,以及如何提高转化效率的思路.本实验综合因素较多,难度较大,是分子生物学中的一个很关键的实验手段.实验原理 转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA,而导致其原来的遗传性状发生改变,这种遗传性状包括遗传型和表型的改变.感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态.用CaCl2处理细菌,改变细胞膜的结构,使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞.然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌,转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落.,（1）利用PCR技术扩增特异性的片段，需要知道该片段两端的一小段序列。因为PCR过程中必须需要引物,（2）引物的长度一般在15-30bp之间16-24最佳，不可超过38bp；可扩增的长度以200-500bp为宜，特殊条件也可达到10kb以上；四种碱基随机分布，但3末端避免出现A，避免5个以上的嘌呤或嘧啶成串排列；避免在引物内部出现二级结构（发卡结构），引物二聚体；在引物中可以添加酶切位点，有利于目的基因和质粒的连接,PCR中的引物,谢谢！,