《原位杂交技术》PPT课件.ppt

原 位 杂 交 技 术,2012-12-06,原 位 杂 交 技 术,一、原位杂交技术的历史发展,原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时 BuongiornoNardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。,二、原位杂交技术的原理及分类,概念：原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。,分类,1、基因组原位杂交技术基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。2、荧光原位杂交技术荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性 原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记 的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切 片上的特异fl-N：行杂交，通过荧光检测系 统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。,3、多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩。4、原位PCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。,三、原位杂交技术的一般过程,以经过标记的已知核酸分子为探针以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交再对其探测,杂交,检测,一）、探针,是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上,1、cDNA2、RNA 3、寡核苷酸,1、cDNA(complementary DNA),互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对）,克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 较稳定，不易被降解 标记方法可靠易行,优点,优点：杂交效率比DNA探针高 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链 缺点：,2、RNA,RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）,容易受RNA酶的污染而被降解,这类探针是根据靶分子而设计序列 在DNA合成仪上用化学方法合成 优点：形成杂交体快速（序列短链，杂交时易于穿透）缺点：特异性较低（短链和简单）,短链探针(长度10-50个核苷酸),3、寡核苷酸,二）、探针标记,1、标记物（1）放射性标记物（2）非放射性标记物2、标记方法（1）DNA探针标记（2）RNA探针标记（3）寡核苷酸探针标记,1、标记物,高度灵敏性；标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；高度特异性；较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；对环境无污染，对人体无损伤；价格低廉等。,放射性标记物：同位素 35S、33P、32P 和 3H等非放射性标记物：荧光素 生物素 地高辛 溴脱氧尿嘧啶等标记分子：某种单核苷酸 在单核苷酸分子中导入某个原子、功能基团或侧链分子作为标记物，对碱基配对不造成影响,标记分子：放射性标记分子：35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP32P-dATP等等非放射性标记分子：四甲基罗达明-UTP 生物素-UTP(Bio-UTP)地高辛-dUTP(Dig-dUTP)溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子,2、标记方法,（1）DNA探针标记 切口移位法 随机引物法（2）RNA探针标记 在体外转录技术中与探针制备同时完成（3）寡核苷酸探针标记 末端转移法,将放射性或非放射性的标记分子 在各种酶促反应中参入探针分子,切口平移法,随机引物法,三）、靶核酸分子,靶分子（或靶序列）：指所要探测的核酸分子或核苷酸序列（DNA 或RNA）DNA 可以是中期染色体上的或是间期细 胞核内的，也可以是线粒体DNA或 病毒DNA RNA 可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子 的mRNA，也可以是核糖体rRNA 线粒体或病毒RNA,四）、杂交,1.杂交体 2.杂交条件 3.严格度的概念,1、杂交体 hybrids,DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA稳定性依次是：DNA-DNA DNA-RNARNA-RNA,2、杂交条件,（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间（1）、杂交液 钠盐（杂交效率 非特异反应）甲酰胺（使杂交所需温度降低）硫酸葡聚糖（提高探针浓度）牛血清白蛋白和载体DNA等（阻断探针与组织非特异结合，背景）,杂交条件,（2）、探针浓度 探针浓度影响杂交反应的速度 放射性标记探针0.5g/ml 非放射性为2g/ml 最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定,（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间,杂交条件,（3）、温度杂交时温度一般低于相应杂交体的Tm值25Tm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度）当杂交液含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时 杂交温度：对DNA探针是42 对RNA探针是50-55 对寡核苷酸探针是37,1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间,杂交条件,（4）、PH pH在5-9范围内，杂交体形成不受影响 常用缓冲液pH为6.5-7.5（5）、时间一般探针浓度下，杂交反应在4-6小时内完成 孵育6小时后-杂交信号不再增强 反应超过24小时后-已形成的杂交体可能发生解 链，杂交信号反而减弱,（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间,3、严格度,在某些条件下，探针可以与含不相配碱基的核 酸序列结合而形成不稳定的杂交体 高严格度条件下 碱基完全互补的双链可形成杂交体 低严格度条件下 碱基对不完全互补的双链也能形成杂交体,严格度（stringency）决定探针是否与含不相配碱基的 核酸序列结合的条件称为严格度,五）、杂交体的探测,使标记的杂交体在光镜或电镜下可见（一）放射自显影方法（二）免疫细胞化学方法,（一）、放射自显影方法,方法：切片上涂覆核子乳胶膜 置于暗盒中于4干燥处自显影 经显影和定影后在显微镜下观察银粒 在细胞和细胞器的分布情况,用同位素标记探针来显示杂交反应的方法,（二）、免疫细胞化学方法,报告分子（reportermolecules）在杂交后探测技术中，为显 示探针标记物而使用的免疫细胞 化学标记物常被叫做报告分子 即与抗体（或亲和素、A蛋白、）联结，最终在 显微镜下可见的分子：荧光素 胶体金 酶-过氧化物酶-H2O2和DAB 碱性磷酸酶-NBT/BCIP 用地高辛标记的探针用荧光素、胶体金、酶标记抗地高辛抗体来显示,依据免疫细胞化学原理用直接法或间接法来显示探针标记物,四、原位杂交技术的应用,细胞特异mRNA转录的定位，用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究。感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位。癌基因、抑癌基因和各种功能基因在转录水平的表达和变化的检测。基因在染色体上的定位和检测染色体的变化间期细胞遗传学的研究疾病的基因变化的研究,THE END,THANK YOU,