《卵母细胞成熟》PPT课件.ppt

卵巢回收时间和温度卵母细胞采集方法卵泡大小卵丘细胞包被 卵母细胞体外成熟的调节机制,卵巢回收时间和温度卵母细胞停留体外时间对成熟影响很大。卵巢回收时间越短越好，最好是离体 2h 内将卵巢取回实验室。研究发现，母猪卵巢离体时间长短影响到体外成熟。与其他哺乳动物相比，猪卵子对温度特别敏感，卵巢的回收温度较高或较低，卵母细胞体外成熟培养效果极差甚至是退化，较合适的回收温度是到达实验室时维持在 3235当卵巢回收温度低于25,猪的卵母细胞将受到冷休克的打击。,卵母细胞采集方法卵母细胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在从离体卵巢上采集卵母细胞时，因采集方法不同，所得卵母细胞体外成熟率间存在一定的差异，如抽吸法成熟率（77.6%）低于切剖法（80.4%）。抽吸法和切剖法相比两者各有优缺点。与抽吸法相比，切剖法虽然费时，但极少破坏卵丘卵母细胞复合体（COCs），这种采集方法更有利于 COCs 的生长发育（陈晓宇等，2002）。注射器抽取有腔卵泡要比用刀片割破所取卵母细胞的数目要少，但是符合取卵时间愈短愈好的原则，因其方便、干净、简捷而被普遍使用。但要注意选择合适的注射器和针头。通常 10mL 注射器加18 号针头是比较合适的。实践发现 10mL 注射器实用操作性比5 和 20mL的好，抽取卵泡的速度也比较快，特别是针头的大小非常重要。针头太大，卵母细胞流失很多，没有足够数量的卵母细胞进行实验；针头太小则抽取过程中卵丘细胞会大量的脱落，因为卵丘细胞对卵母细胞有重要的协同作用，卵丘细胞的脱落将不利于卵母细胞的体外成熟。,卵泡大小不同卵巢上的卵泡大小不一样，同一卵巢上的卵泡大小也不同。一般取直径为 36mm的为宜，其质量较好，卵丘细胞形态好的较多，整体大小比较均匀，核成熟率为 40.8%。哺乳动物大腔卵泡的卵母细胞、小腔卵泡的卵母细胞和原始卵泡都能完成体外成熟和体外受精，但卵泡的大小对卵母细胞的成熟和发育有重要影响。猪卵泡直径直接影响卵母细胞体外成熟率，成熟率较高的卵母细胞是来自中等直径的卵泡，而小卵泡中的卵母细胞成熟率明显下降。来自大卵泡的卵母细胞在体外培养时退化严重（王海，2002）。孟庆刚等（2001）研究了由2mm 以下猪卵泡获得的小、中、大三类卵母细胞，培养 48h 的成熟率分别为 0、22.31%和45.45%。2mm 以下卵泡卵母细胞的成熟率（52.63%）显著低于 26mm 卵泡卵母细胞的成熟率（80.39%）猪卵泡直径只有达到 2mm 以上，其卵母细胞才具备体外成熟的能力，小腔卵泡中的卵母细胞缺乏进一步发育所需的关系因子，大卵泡中卵母细胞的退化可能与其过早成熟而发生老化有关。,卵母细胞的分级,包裹在卵母细胞周围的卵丘细胞的层数也影响着卵母细胞的体外成熟。不同的研究者对卵母细胞的分类不尽一致。根据卵母细胞外卵丘细胞的有无和层数，猪卵丘-卵母细胞复合体分5级5。A级：扩展且颜色较暗，卵丘细胞有5层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞；B级：卵丘细胞颜色较浅且稀疏的，卵丘细胞有5层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞；C级：有35层卵丘细胞紧密包裹的均匀胞质卵母细胞；D级：卵丘细胞稀少，胞质不均匀；E级：裸卵、黑卵。A、B级可以用于体外成熟培养，一般成熟率较高，而C、D级则效果较差，E级不能用于体外培养。,卵丘细胞包被卵丘细胞质量是影响卵母细胞体外成熟的重要因素之一。卵母细胞所需的营养物质依赖卵丘细胞提供，两者间还通过缝隙连接进行信号传导，进而调节卵母细胞的生长和成熟。裸卵仅能够利用周围介质中的丙酮酸和三羧酸循环的中间产物，不能直接利用葡萄糖。卵丘细胞可将葡萄糖转化为丙酮酸，为卵母细胞的生长和发育提供能量。如果两者间缝隙连接被过早破坏，卵母细胞可能停止发育（郑行，1994）。卵丘细胞在卵母细胞离体后至受精前的成熟培养期间里对卵母细胞自身的成熟起着很大作用，从而影响到随后的受精及卵裂过程，而这个作用是随着卵丘细胞层数的增加而提高（杨膺白等，1994）。FSH、LH 通过作用于卵丘细胞上的受体，传递信号或分泌活性物质，作用于卵母细胞，调节卵母细胞发育（Byskov 等，1997）。说明卵丘细胞包裹对于卵母细胞体外成熟有积极作用。,在卵母细胞的体外成熟过程中，卵母细胞成熟率和成熟的质量，取决于卵丘细胞的数量和质量。在卵母细胞体外成熟研究中，一般根据卵丘细胞的数量和扩张的程度分为 4 种类型：即包绕 3 层以上紧密卵丘细胞的卵母细胞为第 1 类；3 层以下的为第 2 类；卵丘细胞扩展而疏松，卵母细胞卵质无斑块的为第 3 类；无卵丘细胞的卵母细胞（裸卵）为第 4 类。李丽立等（2002）对这 4 类卵母细胞体外成熟研究结果表明，达到 MII 期的成熟率分别为 93%、90%、76%、20%，成熟效果依次递减。因为在哺乳动物卵母细胞成熟研究中发现，处于静止期的初级卵母细胞在激素的作用下，若没有卵丘细胞的存在则卵母细胞不能成熟。可见在卵母细胞成熟发育时卵丘细胞直接向卵母细胞发出成熟发育信息。卵丘细胞对卵母细胞有着重要的协同作用，所以卵丘的完整性和卵丘细胞包绕情况对卵母细胞成熟具有重要的作用。因此，在进行猪胚胎体外生产时多选择卵母细胞胞质均匀、透明带完整、具有 3 层或 3 层以上卵丘细胞的 COCs 进行培养。,培养时间,哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时间通常是2224 h。但猪比较特殊，通常需要4448 h左右能达到核成熟，24 h时的核成熟率几乎为零。虽然延长培养时间可以使核成熟率逐步增高,但猪的卵母细胞会逐渐老化。因此，在保证一定的核成熟率的前提下，有必要缩短猪卵母细胞体外成熟培养时间。,卵母细胞体外成熟的调节机制卵母细胞的成熟期是指从减数分裂的前期开始到第二次减数分裂中期为止的这一时期。在此期间，有三个生化因子表现最为活跃，它们是成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）、细胞静止因子（cytostatic factor，CSF）、卵母细胞成熟抑制因子（oocyte maturation inhibitor，OMI）。MPF 催化一些与细胞分裂有关的蛋白质发生磷酸化，促使细胞由间期向 M期转化，CSF 则促进或维持 MPF 的生物活性，使卵母细胞停留在 M 期状态，OIM 主要抑制卵母细胞的成熟分裂。由此可见，MPF 是卵母细胞成熟的中心调控物质，而 CSF 起正调控，OIM 起负调控，它们协同调控卵母细胞成熟的正常进行。另外还有一些分子参与卵母细胞的成熟，如 cAMP、激素、细胞因子和粘多糖等。卵丘细胞包裹的层数，被作为卵母细胞评定的一个指标。因为一些受体在卵丘细胞和卵母细胞上的分布不同，所以在卵母细胞体外成熟过程中需要卵丘细胞的参与。例如一些激素 FSH、LH，还有一些生长因子 EGF 等等，它们的作用要通过卵丘细胞来实现。卵母细胞体外成熟的调节机制卵母细胞的成熟期是指从减数分裂的前期开始到第二次减数分裂中期为止的这一时期。,在哺乳动物卵母细胞内，Plk1 和 Akt 诱导的 MPF 激活在 GVBD 事件中起重要作用。MPF活性能被通过 Cdc25B 和 WeelB 通路的 PKC 和 cAMP 依赖的 PKA 抑制，这个机制不依赖于卵内 MAPK 激活，但卵内 MAPK 的人工激活能诱导 MPF 激活并引起 GVBD。相反地，卵泡颗粒细胞内 MAPK 的激活对于促性腺素诱导的减数分裂恢复是必需的。促性腺素诱导的颗粒细胞内 GPR 的激活引起 p38MAPK 和 cAMP 依赖的 PKA 的激活，这些路径的激活促进前体EGF 家族成员的表达。当这些家族成员前体形式被金属蛋白酶所裂解后，成熟的 EGF 家族成员诱导颗粒/卵丘细胞内 EGFR 的激活，并通过一个为证明的路径激活 MAPK。FSH 刺激定位在卵丘细胞膜上的 FSH 受体，并通过 PKC 和 cAMP 依赖的 PKA 通路激活 MAPK。颗粒/卵丘细胞内激活的 MAPK 的可能的作用是促进 MAS 的表达，通过间隙连接从卵丘细胞转运到和卵母细胞，引起 MPF 激活。另一个可能的作用是刺激类固醇的合成，类固醇与定位在卵上的受体结合，引起卵内 MAPK 激活。颗粒/卵丘细胞内 MAPK 的激活也能引起颗粒/卵丘细胞和卵母细胞内 CX37 和 CX43 的灭活，并中止了 cAMP 从体细胞到卵母细胞的转移。所有这些事件诱导哺乳动物卵母细胞内减数分裂的重新起始。,核与极体的位置,Hoechst33342荧光染色法对猪受体卵母细胞体外成熟过程中 pbI与细胞核相对位置关系的动态变化规律进行观察研究将待测的各试验组 MII期卵母细胞移入含 5 ug/m lHoechst33342的 TCM199中孵育 15 m i n,于荧光显微镜下观察判定 pbI与细胞核的位置关系。,胚胎后期发育记录,3648小时记录卵裂数第六天记录桑葚胚数第七天记录囊胚数,改 良 TCM199(mTCM199),卵母 细 胞 体 外 培 养 基 为 改 良 TCM199(mTCM199),其成分为3.05 mmol/L 葡萄糖、0.91mmol/L 丙酮酸钠、0.57 mmol/L L半胱氨酸、1 mmol/L L谷氨酰胺、10 ng/mL 表皮生长因子(EGF)、10 IU/mL hCG、10 IU/mL PMSG、75ug/mL青霉素、50 ug/mL 硫酸链霉素、10%pFF;,半胱氨酸与卵母细胞成熟,改良的 TCM199 主要是在 TCM199 中添加了 PVA 葡萄糖 丙酮酸钠和半胱氨酸，这其中主要起作用的是半胱氨酸，半胱氨酸是谷胱甘肽的组成成分，谷胱甘肽在细胞生长 氨基酸转移及 DNA 和蛋白质合成中起到重要作用，此外还可以减轻氧压力，起到抗氧化的作用谷胱甘肽(g l u tathione,GS H)是一种具有重要生理功能的三肽硫醇,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。GSH在哺乳动物细胞中发挥着重要的生物学作用,参与卵母细胞的成熟 2。而半胱氨酸是GSH的前体物质,在牛卵母细胞 I VM 时,疏基复合物能增加细胞内的 GS H的浓度,并保持 GS H高浓度状态,从而提高胚胎的发育率 3。工作浓度0.1mg/ml有研究证实,高浓度的半胱氨酸(1.14 mmo l/L)在成熟培养全过程(42 h)中能显著影响囊胚发育 7,用含半胱氨酸的培养液培养猪的卵母细胞,可提高猪卵母细胞的成熟率,也可提高体外受精后的雄原核的形成率。并且,GS H 参与被氧化物质的还原反应,防止脂质过氧化,并以高浓度的形式分布在细胞核和线粒体的周围,保护 DNA 免受氧化反应引起的损伤,有利于早期胚胎细胞克服发育阻滞和进行正常的生长发育 3。,EGF与卵母细胞成熟,在猪的卵母细胞体外成熟培养中，研究较多的就是表皮生长因子(EGF)。EGF是一种卵母细胞成熟的诱导剂，能促进COCs的体外成熟，在COCs上存在EGF受体，随着卵泡的发育表达增强，排卵前达到高峰8。EGF能够诱导猪9、牛10体外培养卵子的卵丘扩散，并促进核成熟。EGF能促进卵母细胞成熟过程中蛋白质的合成，提高卵母细胞质的成熟质量，添加EGF培养成熟的卵母细胞受精后的发育能力更强11。另有研究报道，EGF对猪雌性原核形成有促进作用，EGF不但能促进卵母细胞减数分裂，也间接调节卵母细胞浆的成熟。,卵泡液与卵母细胞成熟,卵泡液是卵母细胞体内发育的介质，含有大量来自血清的生化因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子，对卵母细胞成熟具有重要调节作用。主要表现在提高卵母细胞质成熟的质量，增强胚胎的发育能力。并且，在体外条件下，pFF能有效降低猪卵母细胞染色体异常的发生率，调解和加速极体排出，使核质成熟趋于同步化。但添加过高则抑制卵母细胞核成熟(Yoshida 等)，成熟液中添加10%pFF可促进猪卵母细胞在体外的核成熟。控制其浓度，一方面消除了对核成熟的抑制作用，另一方面又突出了对胞质成熟的促进作用。,激素与卵母细胞成熟,激素是哺乳动物卵母细胞成熟的重要物质。目前,绝大多数研究者在卵母细胞的体外成熟培养过程中，添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物。但是，它们在卵母细胞体外成熟过程中的作用及作用机理尚未清楚。根据已有的研究结果推测，激素诱导卵母细胞恢复减数分裂可能通过2条途径：诱导卵丘扩散使颗粒细胞与卵母细胞的间隙连接中断，使卵丘细胞的信息不能传入卵母细胞，从而解除卵丘细胞对卵母细胞恢复减数分裂的抑制作用，重新启动减数分裂。诱导卵丘细胞产生一些刺激因子，克服抑制物质的作用而恢复减数分裂。现在，体外成熟培养中，主要以添加LH和hCG为主。,囊胚细胞计数,将第 6 天的囊胚取出，用 DPBS-PVA 洗涤 3遍，4%多聚甲醛固定 10 min，再用 DPBS-PVA 洗涤 3 遍,转移到 5 mg/LHoechst 33342 的DPBS-PVA中染色 10 min,压片，荧光显微镜(BX51,Olympus)下进行细胞计数,间接免疫荧光染色技术优化后DPBS0.1%PVP，洗涤2次，2min/次4%PFA(多聚甲醛)固定，RT，15minDPBS0.1%PVP，洗涤3次，5min/次1.0%Triton X-100(v/v)渗透细胞膜，RT，30minDPBS2%BSA封闭，RT，1h一抗(1:100)孵育，RT,1hDPBS0.1%PVP，洗涤3次，10min/次进口二抗(1:100)孵育，38.5,1h，避光DPBS0.1%PVP，洗涤3次，10min/次，避光Hoechst33342(10g/ml)孵育，RT，10min，避光DPBS0.1%PVP，洗涤3次，5min/次，避光封片，拍照，DNA核在UV光下激发而组蛋白乙酰化荧光信号在Blue下激发,荧光免疫染色和DAPI染色实验,实验原理免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。Jagielski M.et.Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。,Triton X-100,Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）。分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。免疫细胞化学中Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，其中1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，0.1%的Triton X-100常用于LAMP（环介导等温扩增），配制BSA等。但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。,PVP聚乙烯吡咯烷酮,PVP具有抗污垢再沉淀性能，可用于配制透明液体或重污垢洗涤剂，在洗涤剂中添加PVP有很好的防转色效果，而且可以增强净洗能力，洗涤织物时可防止合成洗涤剂对皮肤的刺激，尤其对合成纤维，此性能比羧甲基纤维素(CMC)类洗涤剂更为突出。PVP可与硼砂复配，作为含酚消毒清洁剂配方中的有效成分。PVP与过氧化氢固体复配的洗涤剂中，具有漂白、杀灭病菌的作用。,