《切片制作技术》PPT课件.ppt

病理切片制作技术,第一章 组织的取材和固定方法 第二章 组织切片技术 第三章 苏木精-伊红染色方法,第一章 组织的取材和固定方法,病理标本的检查应包括大体和显微镜下观察二个方面，而正确的诊断往往取决于准确的显微镜下观察，因此，制片质量的好坏将直接影响诊断结果的准确性，甚至会带来错误的结果。近年来，免疫组织化学方法在病理学上应用越来越广泛，对取材的要求也越来越高，不仅要求组织细胞的形态保存完整，而且要求最大程度的保存组织或细胞成分的抗原性。抗原性不受损伤是一方面，还要求不能弥散，否则，对于抗原含量较少的标本，抗原性完全丧失，产生假阳性结果，影响病理诊断的准确性，甚至抗原的定位也无从谈起。,第一节 取材,从大体标本上按照病理检查的目的和要求切取适当大小的组织块，供制片进行显微镜检查。一、取材时对送检组织的要求二、取材三、取材时的注意事项四、冰冻切片取材,一、取材时对送检组织的要求,送检组织切取后应立即放入10%福尔马林溶液内固定；尸检标本应争取在死亡后尽可能短的时间内取材；有特殊要求（如细菌培养、结石的化学成分分析等）须事先联系，在标本未固定前进行处理。,二、取材,对送检组织应进行详细检查，根据诊断的需要，确定取材的部位和块数；切取的组织要按不同部位分别给予不同的编号或标记，以便镜检时查对。,三、取材时的注意事项,1注意防止人为损伤 切取组织的刀具应锋利、薄；切取组织块时，避免前后拉动或用力挤压组织，避免使用有齿镊，引起组织结构的变形和损伤。2标本大小 经修整后的组织大小以1.5 cm 1.5 cm 0.2-0.3 cm 为宜。3取材时间 原则上应尽快取材。4注意包埋方向 需指定包埋面的应作记号表明。如皮肤组织的包埋面应与表面垂直，才能保证皮肤的各层结构都能被观察到。5小标本的处理方法 较小的标本（如穿刺材料等）常常用易透水的薄纸包好，在取材时将标本染上伊红液，以免包埋过程中丢失。6注意特殊情况 取材应避免过多的坏死组织或凝血块，组织块上如有血液、粘液、粪便等污物，应先用水冲洗干净再取材。7取材数量 不同的标本取材的组织块多少不同，原则上是凡是可疑处均应取材。一般来讲，除了病变的主体部分外，应注意切取病变组织和正常组织交界处。8清除多余部分 取材时应注意清除组织周围的多余脂肪组织，否则会对以后的切片和观察带来一定的影响。9核对 取材完毕，应核对无误，并签署有关信息和记录日期。10组织存放 取材完毕，标本应按序存放，并加足固定液以备复查。,四、冰冻切片取材,（一）取材 在详细检查的基础上选取最有代表性的组织，必要时应取2块或更多组织块。取材后应立即用液氮速冻，然后在-70或-40低温冰箱保存。（二）注意事项 1液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，以免组织膨胀破碎。2新鲜组织不能放入-10冰箱内缓慢冷却，否则组织内水分可逐渐析出形成冰晶，造成组织结构破坏。3冷冻后的组织块应密封保存，防止脱水。4在组织块复温时，应在37加温速融，自然复温将造成组织结构破坏。,第二节 固定方法,将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为固定。凡需病理检验的各种组织都需经过固定。一、固定的意义二、固定方法的选择 三、固定液,一、固定的意义,1保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。2保持细胞内的特殊成分与生活状态时相仿。经过固定，细胞内的一些蛋白质等可沉淀或凝固，使其定位在细胞内的原有部位，有利于其后物质的确切定位。3便于区别不同组织成分。组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。4有利于切片。固定剂有硬化作用，可使细胞正常的半液体状胶体变为半固体状凝胶，使细胞组织硬度增加，便于制片。,固定剂对组织细胞的不利影响,1影响常规染色。如用福尔马林固定时，常有福尔马林色素的异常沉积。2固定造成物质损失。不同的固定剂和固定方法会引起不同程度的细胞内蛋白质、粘多糖、脂类、核酸和低分子量物质的损失，因此应根据研究目的的不同选择适当的固定剂和固定方法，以使所研究的物质损失达到最小。3组织皱缩。甲醛、福尔马林固定的组织均有不同程度的皱缩。,二、固定方法的选择,（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（二）常用的固定方法（三）固定时注意事项,（一）细胞内物质成分与固定剂的关系,组成细胞的主要成分是蛋白质、脂类和糖类，根据研究目的不同选用不同的固定剂和固定方法，如要保存细胞内糖原用Carnoy液固定，T淋巴细胞表面抗原为不稳定抗原，极易被固定液破坏，因此常用冰冻切片进行染色。,（二）常用的固定方法,1蒸汽固定法 要固定组织中的可溶性物质，一般选用蒸汽固定法；较小而薄的标本，也可用锇酸或甲醛蒸汽固定。主要用于某些薄膜组织以及血液或细胞涂片的固定。2注射、灌注固定法 某些组织块体积过大或固定剂难以进入内部，或需要对整个脏器或动物进行固定。3细胞涂片的固定方法 可采用浸入法和滴加法。用浸入法时，可将新鲜而湿润的涂片直接浸入固定液内，如可能，应每个病例单独固定以免交叉污染。4微波固定法 微波固定的组织具有核膜清晰、染色质均匀、组织结构收缩小的优点，目前已经用于病理诊断。但应严格控制固定的温度，否则会影响组织固定的质量。,（三）固定时注意事项,1固定液的量 固定组织时，固定液的量要充足，一般为组织块总体积的4-5倍。而且应在组织切取后立即或尽快放入适当的固定液中。2固定液的穿透性 一般固定液在24 h内不能穿透厚度大于2-3 mm的实体组织或0.5 cm的多孔疏松组织。3组织块的大小 厚度可根据组织类型而不同，原则上不应超过4 mm，以3 mm更为适宜。4固定时间 大多数组织应固定24 h。固定的时间与使用固定液的种类、组织块大小、温度等有关，不同的固定液有不同的固定时间，一般固定时间为3-24 h。5固定温度 大多数可在室温（25）固定，在低温固定时，固定时间应相应延长。6加热 加热可使蛋白质凝固，但一般不要求加热，因为加热可加速组织的自溶。7特殊固定 用于确诊病变，保证在诊断时特殊结构保存完好。如尿酸盐结晶就需要特殊固定。,三、固定液,用于固定组织的化学物质称为固定液或固定剂，一般由单一化学物质组成者称为固定剂或单纯固定液；由多种化学物质混合组成者称为混合固定液或复合固定液。（一）单纯固定液（二）混合固定液,（一）单纯固定液,1甲醛（formaldehyde）2重铬酸钾 3苦味酸 4锇酸（四氧化锇）5丙酮 6酒精,1甲醛（formaldehyde）,市售的为40%的甲醛水溶液，也称为福尔马林（formalin）。此液久存自行分解，形成白色沉淀为副醛（三聚甲醛或多聚甲醛），可过滤后使用，但这种溶液中有甲酸产生，使溶液呈酸性，影响细胞核的染色，因此，储存时间长的甲醛应放入少量碳酸镁或碳酸钠，或用大理石中和。在40%甲醛中加入甲醇可阻止聚合作用。一般作为固定剂使用的10%的甲醛，是用水和40%甲醛（9:1）混合而成，实际上是4%甲醛。甲醛水溶液渗透能力强，固定均匀，组织收缩小，但经乙醇脱水后收缩较大。甲醛为非沉淀性固定剂，不能使白蛋白和核蛋白沉淀。甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。因其价格较低，可用于固定和保存大标本。长时间固定的标本，甲醛氧化产生的蚁酸在组织中与血红蛋白形成棕色的福尔马林色素，在制片前应注意充分流水冲洗，否则可能影响染色效果。,2重铬酸钾,常用其1%-3%水溶液作为固定剂。未酸化的重铬酸钾不能使蛋白质沉淀，但可以使蛋白质变为不溶性，保持其生活时的状态，对于细胞质的固定较好，并且可固定类脂类物质使其不溶于脂溶剂。用于固定高尔基体和线粒体有良好效果，但有溶解染色质的缺点，染色质保存相对较差。,3苦味酸,是一种强酸，易燃易爆。一般应配成饱和溶液储藏，常用其饱和溶液作固定剂。苦味酸能沉淀一切蛋白质，穿透慢，组织收缩明显，但组织没有明显硬化，可使皮肤软化，因此皮肤组织用苦味酸或其混合固定液固定时，易制作完整的切片。用含苦味酸的固定液固定组织时，时间不宜超过24 h，固定后的组织应尽快放入70%的酒精，并在酒精中滴加少量饱和碳酸锂水溶液或浓氨水，有助于除去苦味酸固定产生的黄色。,4锇酸（四氧化锇）,为强氧化剂，不能与酒精、甲醛等混合。常用其1%-2%的水溶液作为固定液。是电镜研究必需的固定剂，常用于后固定。锇酸的渗透力极弱，易使组织变硬，固定的组织块应小，否则内部固定效果不好。但延长固定时间，组织的脆性增加，对染色不利。,5丙酮,可与水、醇、氯仿和醚等混合，可使蛋白质沉淀，渗透力强，对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定（如磷酸酶、脂酶和氧化酶等）。作用基本与酒精相同。,6酒精,即乙醇。有固定兼脱水作用，固定速度较慢，易使组织变脆。用于固定的浓度为80%-95%。用于糖原的固定，如肝组织等糖原染色。酒精的渗透力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。但核蛋白经沉淀后，能溶于水，不利于染色体的固定。高浓度乙醇固定的组织硬化显著，时间过长组织变脆，收缩明显。酒精一般不作常规固定剂，用酒精固定时，常先用80%酒精固定数小时，再换95%酒精继续固定。,（二）混合固定液,1B-5固定液 2Bouin液 3Carnoy液 4Helly液 5甲醛-生理盐水 6中性缓冲甲醛液7中性甲醛液,1B-5固定液,即醋酸钠-升汞-甲醛固定液。多用于固定淋巴组织。用该液固定的组织，在染色前应进行脱汞处理。,2Bouin液,常用于活检标本固定的固定液。用于固定大多数组织和器官，适用于结缔组织染色。固定效果好，组织细胞结构完整。细胞核着色鲜明，但细胞质着色较差。对脂肪的固定效果好，尤其适用于含脂肪的淋巴结、乳腺组织和脂肪瘤标本的固定。固定液偏酸，对抗原有一定的损害，使组织收缩，不适宜于标本的长期保存。固定后组织被染成黄色，需用70%-80%酒精洗涤。在酒精中加入饱和碳酸锂水溶液有助于清除组织块的黄色。,3Carnoy液,固定细胞浆和细胞核，对染色体的固定佳，显示DNA和RNA效果较好。也常用于糖原和尼氏体的固定。不适宜于保存脂类，不适宜于脂肪染色。固定液有防止酒精的硬化和收缩作用，增加渗透力，可用作外膜致密不易渗透的组织的固定。该液固定速度快，3 mm厚的组织块1 h即可固定，大块材料最好不超过4 h。,4Helly液,又成为Zenker福尔马林液。对细胞质固定效果好，显示某些细胞质内特殊颗粒有独特优越性，对骨髓等造血器官的固定效果好，对心肌的闰盘保存也有良好效果。,5甲醛-生理盐水,应用最广泛的一种固定液，可保护脂类和细胞核。,6中性缓冲甲醛液,为免疫组织化学最常用的固定液，对组织的穿透性好，组织收缩小。对大多数抗原物质保存较好，对细胞膜的通透性有影响，可能使某些大分子抗原失去活性。固定时间以24 h以内为宜。固定液配方：40%甲醛 10 ml，0.01 mol/L PBS（pH 7.4）90 ml。,7中性甲醛液,是最常用的固定液之一，固定效果好。,第二章 组织切片技术,在取材后，经固定的标本如组织块较厚则应进行修整。有条件的应根据组织块大小分别进行脱水、透明、浸蜡和包埋，包埋好的组织块即可按需要进行切片。第一节 组织的脱水、透明、浸蜡第二节 组织的包埋和包埋方法 第三节 组织切片法,第一节 组织的脱水、透明、浸蜡,一、脱水 二、透明 三、浸蜡 四、骨和含钙组织脱钙法,一、脱水,脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前必须进行脱水。脱水剂必须能与水以任意比例混合，至于选用何种脱水剂，应根据固定剂的要求，不要任意选用，否则无法得到满意结果。现将一些常见脱水剂及其性能和注意事项简介如下：(一)酒精(二)丙酮（三）异丙醇（四）正丁醇和叔丁醇,(一)酒精,是最常用的脱水剂之一。它可与水随意混合，脱水能力较强，并且可硬化组织。酒精的穿透速度很快，对组织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩，在用酒精作为脱水剂时，应从低浓度开始，然后再依次增加其浓度。一般从70酒精开始，经80%、90、95酒精，尔后至无水酒精。对于少数柔嫩组织应从50或30酒精开始脱水。但也应注意，对于一些需特殊处理的标本，如进行糖原和尿酸盐结晶染色的标本，为较好的保存物质的结构（它们在水中会溶解消失），应直接用无水酒精固定。经无水酒精固定的组织，更换一次无水酒精脱水即可。一般情况下，组织经上述处理，即可达到脱水要求。但大量组织块同时进行脱水时，为达到满意的脱水效果，常经过95酒精和无水酒精各两次。但注意组织块在纯酒精中放置时间不宜过长，防止组织过度硬化造成切片困难。无水酒精经应用后，很难保证无水，因此应在无水酒精容器内加人硫酸铜吸收水分。硫酸铜遇水变蓝后，即应更换无水硫酸铜或更换纯酒精。但放人容器的硫酸铜最好不要与组织块接触，可在硫酸铜表面加一块滤纸。对于标本量较大的单位，应经常更换酒精，对于标本量少，又不经常进行切片的基层单位，可用以上方法。脱水的时间与组织块大小有关，对于1.5 cm1.5 cm0.2-0.3 cm的组织块，一般脱水时间如下：70酒精数分钟，80、95、95、100、l00酒精各2-4 h，将酒精在温箱加温可缩短脱水时间。对于小块组织，80-100酒精30-45 min即可。但对于结构紧密的组织（如致密结缔组织等）和大块组织则不适用，应根据具体情况进行调整。另外，脂肪组织和疏松结缔组织应延长脱水时间，在95酒精中水分必须洗净，脂肪必须溶解掉。否则石蜡不能渗入脂肪细胞和纤维组织，无法切出好的切片，而且染色时也容易脱片。这样的组织蜡块，因含有水分，经与空气接触后即干燥出现凹陷。,(二)丙酮,丙酮的脱水作用与酒精相似，但对组织块的收缩作用比酒精更严重，因此一般很少单纯应用丙酮作脱水剂。在快速脱水或固定兼脱水时有时应用，脱水时间约l-3 h。丙酮可作为染色后的脱水剂，用于DNA和RNA染色。,（三）异丙醇,是酒精的良好代用品，不含水，可代替无水酒精使用。脱水后组织收缩小，对组织的硬化作用也较弱。对火棉胶和染料不溶，因此不能用于火棉胶包埋和染料配制。在常规制片中很少应用。,（四）正丁醇和叔丁醇,正丁醇是无色液体，脱水能力较弱，可和水、酒精和石蜡混合，因此这种脱水的组织块可直接浸蜡和包埋。叔丁醇无毒，可与水、酒精、二甲苯混合。可单独使用，也可与酒精混合使用，是目前常用的一种脱水剂。与正丁醇相比，它不易使组织收缩或变硬，而且脱水后可不经透明直接浸蜡，浸蜡前先经过叔丁醇和石蜡1:1混合液。电镜标本制作时常用作中间脱水剂。,二、透明,为使石蜡能浸人组织块，组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。在这一过程中，因组织块中的水分被溶剂（如二甲苯）取代，其折射指数接近于组织蛋白的折光指数，组织块变得透亮，因此称之为透明。组织染色后，也要进行透明。用作透明剂的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮等。（一）二甲苯（二）苯和甲苯（三）氯仿,（一）二甲苯,是常用的透明剂，其折射指数（refractive index，RI）为1.50。它对组织的收缩性强，易使组织变硬变脆。因此，组织块（3-4mm）在二甲苯中一般30 min即可使组织透明，时间不宜过长。组织块可先经过1:1无水酒精、二甲苯混合液处理，再浸人二甲苯。切片染色后进行透明，不会使苯胺染料退色。如进入二甲苯时出现浑浊，说明脱水不充分。,（二）苯和甲苯,苯（RI=1.50）和甲苯（RI1.50）与二甲苯的性质相似，对组织收缩较小，与二甲苯相比，不易使组织变脆。但透明速度慢且挥发快，吸人苯易引起中毒，操作应在通风橱或空气较流通处进行。苯对组织的收缩小，不引起组织硬化变脆，适于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透明。脱水至无水酒精时即可进入纯苯透明，可长时间停留。甲苯多用于切片染色后的透明。,（三）氯仿,氯仿也不易使组织变脆变硬，但透明能力比二甲苯差，其RI1.45，且极易挥发和易吸收水分，用作透明剂时，多用于大块组织（1 cm）的透明，而且应在容器内放置无水硫酸铜。总体比较来看，以二甲苯最为常用，而且一般工业用二甲苯即可达到透明效果。用二甲苯透明时，一般经过2-3次纯二甲苯溶液，每次10-15min。同时也应根据组织的种类和组织块大小以及液体的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。如脑组织和凝血块，应缩短在二甲苯内的留置时间。而肌肉组织和胃肠组织则应延长。,三、浸蜡,组织经透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过2-3次石蜡浸渍才能完成。在第一次石蜡中加入少量二甲苯或用低熔点的软蜡，尔后再浸入高熔点的硬蜡效果更好。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56。但具体应用时还应考虑当时的情况，一般在夏天气温较高的情况下，应采用高熔点的硬蜡，而在气温较低的季节，应用低熔点的石蜡，这样有利于切片制作。组织块总的浸蜡时间约3-4 h。当然也应根据组织块的种类和大小以及温度情况加以灵活掌握。时间不宜过长，否则易造成组织块脆硬，时间不足，也难制作良好的切片。,对于一般的动物组织，脱水、透明和浸蜡时间如下：75酒精 长短不定 85酒精 120-300 min 95酒精I和 II 120-300 min ll 无水酒精I、II 和 III 30 min 无水酒精 III 60-120 min 二甲苯I和 II 30 min 二甲苯III 60 min 56-58石蜡 30 min 56-58石蜡 60-120 min 56-58石蜡 120-180 min,四、骨和含钙组织脱钙法,骨、牙齿和有钙化的组织在充分固定后，应进行脱钙处理。脱钙组织的厚度不宜超过4 mm。牙齿和骨可先锯开，而后用砂轮磨成薄片脱钙，有钙化的组织再经脱钙液浸泡短时即可。组织脱钙有多种方法，常用的有以下几种：（一）酸性溶液脱钙法（二）螯合剂脱钙法（三）脱钙后处理,（一）酸性溶液脱钙法,1硝酸脱钙法 常用脱钙液，10硝酸水溶液（加少量尿素），硝酸10 ml和10甲醛90 ml的混合液。组织块经甲醛固定后，先用5硝酸溶液脱钙。每日更换脱钙液，早晚各一次，直至用针刺入组织无阻力感为止，一般2-3天，组织若柔软性较好，用镊子可弯曲120而回弹，说明脱钙完全。如不够，可延长时间，但时间过长，将影响染色。流水冲洗24h即可。有时对脱钙液进行钙盐试验以确定脱钙是否完全。可取用过的脱钙液5 m1，加浓氨水l ml，充分混合后，加草酸铵饱和水溶液0.1 m1，若有沉淀生成，说明脱钙还不充分，若液体透明，说明已完全脱钙。2盐酸脱钙法 常用的脱钙液，盐酸8.5 ml，甲酸5 m1，氯化铝7 g，蒸馏水100 ml。盐酸和甲酸各20 m1，蒸馏水100ml。方法同上。,（二）螯合剂脱钙法,1此法对组织无损伤，但脱钙速度慢。组织内酶的活性保留，可用于组织化学染色的小块骨组织。对组织抗原性的损伤也较小，因此用于免疫组织化学染色也较为理想，骨组织超薄切片在预固定后常用EDTA进行脱钙处理。2用EDTA（乙二胺四乙酸）溶液：EDTA 10 g，溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）或Tris缓冲液（）100 ml中。3薄片组织放人EDTA溶液脱钙，4天更换1次新液，需数周才能脱钙完毕。4脱钙后的组织，经流水冲洗以除去组织中的EDTA，而后按常规处理。,（三）脱钙后处理,1脱钙后的组织用流水冲洗15-30 min，也可先用碳酸钠中和。2修去锯面的薄层组织，切成适当大小的组织块，常规处理，注意脱水应充分，否则组织易脆，切片困难。,第二节 组织的包埋和包埋方法,组织块经过浸透剂（石蜡、火棉胶、树脂等）浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、树脂等）包起的过程称包埋。不同的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成含组织的块。经包埋后，可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。不同的包埋剂，其包埋方法不同，分别简述如下。一、常规石蜡包埋法 二、石蜡半薄切片包埋法,一、常规石蜡包埋法,在进行石蜡包埋时，先将熔化的石蜡倒入包埋框，尔后用加温的镊子将浸蜡的组织块放人。在石蜡中有杂物时应进行过滤后再使用。包埋时首先注意有无特殊的包埋面（如分层组织，皮肤等），包埋面必须平整。包埋温度不应过高，否则易造成组织块的烫伤，影响诊断。另外，包埋蜡的温度与组织块的温度应接近，不然会引起组织块与周围石蜡的脱裂。包埋一般用56的石蜡，也应根据气温条件作相应调整，以组织块具有合适的硬度、能切出高质量的切片为标准。同时注意过硬的组织一般用较硬的石蜡包埋，而柔嫩的组织多应选用硬度低的石蜡。在包埋完毕，蜡块稍凝后，可移入冷水或冰箱加速凝固。工业石蜡，密度疏松，应反复多次熔化和冷却，使其密度增加。,二、石蜡半薄切片包埋法,制作半薄切片的组织，应经固定液充分固定，根据组织类型进行脱水、透明和浸蜡。1穿刺组织和细小的话检组织 95酒精脱水2 h，每30 min更换新液一次；无水酒精2 h，每30 min更换新液一次；无水酒精-氯仿等量混合液30 min；氮仿透明2 h，每30 min更换新液一次；60 62石蜡浸蜡3 h，每l h更换新液1次。2一般软组织（厚度不超过2 mm）95酒精2 h，每30min更换新液一次；无水酒精4 h，每1 h更换新液一次；无水酒精-氮仿等量混合液1 h；氯仿透明3 h，每1 h更换新液一次；60 62石蜡浸蜡3 h，每1 h更换新液一次。3皮肤、平滑肌瘤等韧性较大的组织（厚度2 mm)95酒精2 h，每l h更换新液一次；无水酒精2 h，每l h更换新液一次；松脂醇（松节油也可代替）18 24 h，更换2次；氯仿透明3 h，每1 h更换新液一次；60 62石蜡浸蜡4 h。在60 62石蜡中加入松香（占总量4 6）混合调匀后用作包埋剂，包埋前组织可先在其中浸透30 60 min。,第三节 组织切片法,组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡包埋半薄切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀仪器等。以下以石蜡切片法为例加以叙述。组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。为现在病理诊断常用的制作切片方法。在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切4-6 m厚的切片，特殊情况可切1-2 m。要观察病变的连续性可制作连续切片。除此之外，石蜡包埋的组织块便于长期保存，因此石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用、最普遍的一种方法。一、切片前的准备 二、切片制作过程 三、切片的注意事项,一、切片前的准备,1固定后的标本经脱水、透明、浸蜡和包埋后，制成蜡块。高质量的蜡块和锋利的切片刀是保证切片质量的关键环节。检查切片刀是否锋利，简便的方法是用头发在刀锋上碰一下，如一碰即断，说明刀锋锋利。用显微镜观察可确定刀口是否平整，有无缺口。2准备充足的经过处理的清洁载玻片和恒温烤片装置，大、中号优质狼毫毛笔和铅笔。,二、切片制作过程,1预先修好的组织块先在冰箱中冷却，而后装在切片机固定装置上。将切片刀装在刀架上，刀刃与蜡块表面呈5 夹角。将蜡块固定，调整蜡块与刀至合适位置，并移动刀架或蜡块固定装置，使蜡块与刀刃接触。2切片多使用轮转式切片机，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，但小标本注意不要修得太多，以免无法切出满意的用于诊断的切片，大标本应注意切全。切出蜡片后，用毛笔轻轻托起，尔后用眼科镊夹起，正面向上放人展片箱（40左右)，待切片展平后，即可进行分片和捞片。为减少切片刀与组织块在切片过程中产生的热量，使石蜡保持合适的硬度，切片时可经常用冰块冷却切片刀和组织块，尤其在夏季高温季节更为必要。3轮转式切片机切取组织，是由下向上切，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端(如皮肤组织，应将表皮部分向上。而胃肠等组织，应将浆膜面朝上)。4捞片时注意位置，要留出贴标签的空间，并注意整齐美观。捞起切片后，立即写上编号。5切片捞起后，在空气中略微干燥后即可烤片。一般在60左右烤箱内烤30 min即可，也可用烤片器烤片。血凝块和皮肤组织应及时烤片。但对脑组织（较大组织等）待完全晾于后，才能进行烤片。否则可能产生气泡影响染色。,三、切片的注意事项,1组织的取材和固定 2组织脱水、透明和浸蜡3切片4切片刀和切片机5特殊要求切片的制作,1组织的取材和固定,取材时，组织块的大小厚薄应适当，过大、过厚的组织，固定液不易渗透，易引起固定不良。过小、过薄的组织，在固定和脱水的过程中易变硬或产生弯曲扭转，同样影响切片质量。陈旧、腐败和干枯的组织不宜制作切片。用陈腐组织制成的切片，往往核浆共染，染色模糊，组织结构不清，无法进行观察。固定不及时和固定不当的组织，染色时常出现核质着色较浅，轮廓不清，出现不同程度的片状发白区。组织固定时，固定液的量应充足，至少要在4倍以上，同时注意组织块不要与容器粘连。至于组织固定的时间，根据具体情况加以掌握。,2组织脱水、透明和浸蜡,组织脱水用的各级酒精，应保证相应浓度，以便组织脱水彻底。但无水酒精中，组织块放置时间不宜过长，否则组织过硬，切片困难。遇到此情况，可将组织浸在香柏油中软化，用二甲苯洗去香柏油后，再重新浸蜡和包埋。脱水酒精，尤其是无水酒精中混有水分时，组织脱水不干净。经二甲苯时，组织也无法透明，呈现浑浊。此时应将组织在新的酒精中重新脱水。二甲苯透明也应充分，否则不利于石蜡的浸透。但组织在二甲苯内的时间应严格掌握，时间过长组织易碎，也无法切出好的切片、时间不足，则石蜡不易浸透。浸蜡的温度也不宜过高，时间长短也应加以控制。总之，组织脱水、透明和浸蜡对于切片质量都有一定影响，组织脱水、透明和浸蜡过度，组织块变硬变脆，因此对于小块组织或小动物标本应注意时间。但若时间不够，组织块硬化不够，也不利于切片和染色，对诊断带来困难。因此应注意各具体环节的操作，并注意保证各种试剂的质量。,3切片,组织块固定不牢时，切片上常形成横皱纹。切片刀要求锋利且无缺口，切片自行卷起多由切片刀不锋利所致，切片刀有缺口时，易造成切片断裂、破碎和不完整。骨组织切片时，用重型刀较好。,4切片刀和切片机,切片刀放置的倾角以20-30为好。倾角过大切片上卷，不能连在一起。过小则切片皱起。应注意维护切片机，防止因螺丝松动产生震动，切片时会造成切片厚薄不均。遇硬化过度的肝、脑、脾等组织时，应轻轻切削，防止组织由于展动产生空洞现象。,5特殊要求切片的制作,石蜡切片虽然有很多优点，但制片过程中要经过酒精和二甲苯等有机溶剂处理，因此很易造成组织内抗原性的丧失，在用于免疫组织化学染色时影响结果的准确性。因而有人采用冷冻干燥包埋法，即将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机在真空和低温条件下除去组织内的水分，然后用甲醛蒸汽固定干燥后的组织，而后在进行浸蜡、包埋和切片。此法可保存组织内的可溶性物质，防止蛋白质变性和酶的失活，减少抗原的丢失。用于免疫荧光标记、免疫酶标记和放射自显影。,第三章 苏木精-伊红染色方法,第一节 苏木精伊红染色的基本原理第二节 苏木精伊红染色方法第三节 染色液的配制第四节 染色中注意事项,第一节 苏木精-伊红染色的基本原理,苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色方法，简称HE染色方法，是生物学和医学的细胞与组织学最广泛应用的染色方法。教学和研究都是用HE染色方法观察正常和病变组织的形态结构。因此病理学工作者必需学习和掌握这种染色方法。一、细胞核染色的原理 二、细胞浆染色的原理 三、染色中二甲苯、酒精和水洗作用 四、分化和蓝化作用,一、细胞核染色的原理,细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。,二、细胞浆染色的原理,细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物，细胞浆的染色与pH值有密切关系，当调到蛋白质等电点47-50时，脑浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当PH调至67-68时，大于蛋白质的等电点的pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可与带正电荷的染料染色，同时胞核也被染色，胞核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子)，就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷(阳离于)结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。伊红是细胞浆的良好染料。,三、染色中二甲苯、酒精和水洗作用,1二甲苯的作用 石蜡切片的常规染色必须先用二甲苯脱去切片中的石蜡，其作用是二甲苯可以溶解切片中的石蜡，以使染料易于进入细胞和组织，因为石蜡的存在妨碍水和染料进人细胞。染色后二甲苯起透明切片的作用，以利于光线的透过。2酒精的作用 酒精用于苏木精染色前由高浓度向低浓度逐渐下降处理切片，是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯，使水能进人细胞和组织中，因为纯酒精可以和二甲苯互溶，二甲苯经过二次纯酒精的洗涤完全被除去，再经过95、80酒精使水分逐渐进人切片，以免引起细胞形态结构的人工改变。伊红染色以后的酒精由低浓度80、90、95酒精向 l00酒精逐渐过度是为了逐渐脱去组织中的水份，为二甲苯进入细胞创造条件，这时必须彻底脱水，否则二甲苯不能进入细胞，组织切片透明度达不到光学显微镜观察时透光度的要求，在显微镜下不能显示清晰的细胞和组织结构。3水洗的作用 在脱蜡经酒精处理之后，用水洗切片，使切片中进入水，才能使苏木精染液进入细胞核中，使细胞核染色。染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染液。分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料，中止分化作用。在伊红染色之后也可以用水洗去未结合的染液，以防止大量伊红染波进入脱水的酒精中。,四、分化和蓝化作用,1分化作用 苏木精染色之后，用水洗去未结合在切片中的染液，但是在细胞核中结合过多的染料及胞浆中吸附的染料必须用1盐酸酒精溶液脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木精的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。2蓝化作用 分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态而呈蓝色。所以分化之后用水洗除去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈篮色，称蓝化作用。一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用稀氨水或温水变蓝。,第二节 苏木精伊红染色方法,一、人工操作的苏木精伊红染色方法 二、冰冻切片的苏木精伊红染色,一、人工操作的苏木精伊红染色方法,1染色步骤（1）二甲苯I脱蜡 10 min（2）二甲苯II脱蜡 5 min（3）无水乙醇洗去二甲苯 l ml2次。（4）95酒精l min（5）90酒精1 min（6）85酒精l min（7）自来水洗2 min（8）苏木精染色1 min至5 min（9）自来水洗l min（10）1盐酸酒精分化20 s（11）自来水洗l min（12）稀氨水（1）反蓝30 s。自来水洗或蒸馏水洗1 min（13）伊红染色20 s至5 min（14）自来水洗30 s。（15）85酒精脱水20 s（16）90酒精30 s（17）95酒精I 1 min（18）95酒精II 1 min（19）无水乙醇I 2 min（20）无水乙醇II 2 min（21）二甲苯I 2 min（22）二甲苯II 2 min（23）二甲苯III 2 min（24）中性树胶或加拿大树胶封片 2染色结果 细胞核呈蓝色，细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。,二、冰冻切片的苏木精伊红染色,1恒冷箱冰冻切片，粘贴在载玻片上，用95酒精95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1 min。自来水洗 2苏木精染色1-2 min 3自来水洗30 s 41盐酸酒精分化20 s 5自来水洗20 s 6稀氨水20 s 7自来水洗20 s 8伊红染色20 s-1 min 9自来水洗10 s 1985酒精20 s 1190酒精30 s 1295酒精1 min 13无水乙醇I 1 min 14无水乙醇II 2 min 15二甲苯I 1 min 16二甲苯II 2 min 17二甲苯III 2 min 18中性树胶或加拿大树胶封片,第三节 染色液的配制,一、苏木精的配制 二、伊红溶液的配制三、盐酸酒精分化液的配制,一、苏木精的配制,1Harris苏木精的配制 苏木精1g 硫酸铝钾15 g 无水乙醇10 ml 蒸馏水200 ml 先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加人红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。2Mayer苏木精改良配法(!)A液 苏木精2 g 无水乙醇40 ml(2)B液 硫酸铝钾100 g 蒸馏水600 ml 稍加热使硫酸铝钾在水中溶解，将苏木精溶于酒精中，再将A与B液混合煮沸2min。用蒸馏水补足600 ml，加入400 mg碘酸钠充分混匀，苏木精染液呈紫红色。,二、伊红溶液的配制,1水溶性伊红 伊红Y 0.5-1 g 蒸馏水100 ml 先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100 ml加冰醋酸l滴。2乙醇性伊红液的配制 伊红Y 0.5-1 g 90酒精100 ml 先将伊红溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100 ml加冰醋酸l滴。用乙醇性伊红液染细胞后可不经水洗，直接用85酒精脱水。,三、盐酸酒精分化液的配制,浓盐酸 0.5-1 ml 75酒精 99 ml 此液用一段时间后需要延长或更换液体，新液分化时间要短。,第四节 染色中注意事项,1脱蜡 石蜡切片必需经过脱蜡后才能染色，脱蜡前切片要经烘烤，这样使组织与玻璃片粘贴牢固。组织切片脱蜡应彻底，脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间，所有的时间都是指新的二甲苯在室温25以下时，如果二甲苯已经用过一段时间，切片又比较厚，室温低则应增加脱蜡时间，脱蜡不净是影响染色的重要原因之一。2染色 石蜡切片经水洗后放入Harris苏木精染色，一般情况下在新配的苏木精溶液中只需要染1 min左右，应根据染片的多少，逐步把染色时间延长。苏木精染色后，不宜在水中和盐酸酒精停留过长，切片分化程度应在镜下观察，分化过度，应水洗后重新在苏木精中染色，再水洗分化，使切片在自来水或稀氨水中充分变蓝。新配的伊红染色快，切片染色不宜过长，应根据染切片的多少逐步延长染色时间，切片经伊红染后，水洗时间要短。3脱水 切片经过染色后，通过各级酒精脱水，首先从低浓度到高浓度，低浓度酒精对伊红有分化作用，切片经过低浓度时间要短，向高浓度时逐步延长脱水时间，脱水不彻底，使切片发雾，在显微镜下组织结构模糊不清。4透明与封片 石蜡组织切片染色经过脱水后必须经二甲苯处理，使切片透明，才能用树胶封片。常用切片封片胶有国产的中性树胶，光学树胶，加拿大树胶和合成树脂（DPX）。在封片时，树胶不能太稀或太稠，不能滴加的太多或太少，太稀或太少切片容易出现空泡，树胶也不可太多，不要使树胶溢出玻片四周太多。标签要附贴牢固。封片时不能对着切片呼气。5常规石蜡切片和HE染色标本的质量标准（全国统一评定标准）(1)切片完整，厚度46 m，薄厚均匀，无摺无刀痕。(2)染色核、浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。,