《共焦拉曼光谱何靖》PPT课件.ppt

共焦拉曼光谱,何靖,拉曼散射概念,1928年，印度物理学家拉曼在实验中发现，光通过介质时，会由于入射光与分子运动相互作用而引起频率的变化，这一现象称为拉曼散射拉曼散射的经典解释：在某一入射光范围内，单位体积的感生偶极矩M与入射电矢量E成正比，一级拉曼效应中的电子极化率随时间的变化规律,感生偶极矩M可以表示：,式中除了与瑞利散射相应的 特征量，还出现了与拉曼散射相应的特征量，这就是拉曼散射光的频率和波矢,它们分别表示非弹性拉曼散射过程中所遵循的能量守恒和动量守恒定律，由此构成了拉曼散射的选择定则。,拉曼散射的量子解释,利用用量子力学理论，不仅可解释拉曼散射中的散射光的频率差，还可解决强度和偏振等问题,.拉曼光谱的优缺点,拉曼光谱首先可对物质做定性分析，因为不同的物质具有不同的特征光谱，因此可以通过其光谱特性对样品进行定性分析。利用拉曼光谱还可以对样品分子的含量进行定量分析，依据光谱对样品浓度、温度的敏感性可进行一定程度的定量分析优点：1 测定无须借助任何标记物 2 可对溶液、气体、固体、薄膜、晶体等各种形式的物体进行实验 3 可在很短的时间内快速获得缺点：1 拉曼散射信号较弱，故对样品的浓度要求高 2 采用波长较短激光做激发光时，容易引发样品荧光，从而常使拉曼光谱受到荧光的干扰,共焦技术,共焦技术使得只有焦平面的信号可通过信号通道进入接收系统，而焦平面上或下的信号则被共焦孔阻挡,。样品照明光阑针孔与光电检测光阑针孔互为共扼形成了共聚焦显微光路。共焦显微镜利用共焦技术可对更精细位置的物质进行探测。,真共焦显微技术,这种技术是将激光聚焦到样品中的某一点，这样只有该照射点附近的区域有激发的拉曼光，其他没有被激发的部位没有拉曼光,这一区域发出的拉曼光经由显微镜之后，能够完全通过“共焦针孔”。偏离光轴的任何邻近区域的信号都会被针孔阻挡；即使在光轴上，在样品不同深度处（偏离照射点）的信号也因散焦而绝大部分通不过针孔,这时，位于取样点（即照射点）的“像斑”处的针孔起到了空间滤波的作用；通过调节针孔孔径，可以控制及精确地界定被探测区域的轴向位置和横向尺寸。最后再将拉曼光反射到 CCD 接受器,简单共焦显微技术,在简单共焦中，最主要的措施是：在样品照射点的“像斑”处，不用共焦针孔，而用狭缝（就用单色仪的入口狭缝）。这样做，就把共焦针孔的二维空间滤波简化成狭缝的一维空间滤波了。这时，垂直于狭缝的杂散干扰虽被阻挡，和狭缝位置一致的条状区域的有用信号、杂散干扰却全部进入单色仪。作为补救，限制 CCD 探测器上像素的读取行数，使得除了样品照射点的信号可被正常读取之外，狭缝两端通过的杂散干扰尽量少被读取。于是，狭缝作为一维空间滤波，限制像素的读取行数作为另外的一维（与狭缝垂直）滤波，共同形成一个虚拟的“方孔”，而称为“赝共焦”,对不同pH 环境下鳄鱼红细胞内血红蛋白结构功能研究,目的：揭示鳄鱼红细胞及其血红蛋白随不pH 环境下的结构功能状态的变化规律方法：鳄鱼血活体采集后用肝素抗凝，无菌分离出细胞后加入pH 值分别为2.55、3.02、4.39、5.50、6.58、7.13、7.82、8.31、8.80、10.0 的细胞缓冲溶液中，静置20 min 后，使用拉曼光谱仪进行扫描获得红细胞拉曼谱，通过分析测定获得其血红蛋白的分子结构与携氧功能随pH值变化的情况,主要仪器：台式离心机（上海安亭科学仪器厂），pH 计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），显微激光共聚焦拉曼光谱仪（法国Horiba JY 公司）。红细胞制备：鳄鱼血活体采集后肝素抗凝，以2000 r/min 离心5 min，去除上层白细胞和血小板。取压积红细胞用10倍浓度0.145 M 的生理盐水稀释，以2000 r/min 离心3 min，洗涤三次，加入PBS 缓冲液混匀，25下静置20 min。,拉曼散射光谱测定：将制备好的鳄鱼红细胞样品滴加到玻片上，显微镜平台为奥林巴斯倒置显微镜，用法国JY 公司生产的显微共焦拉曼光谱仪进行测量，激发光波长为633nm 氦氖激光。测量范围选择500 cm-11800 cm-1，波数分辨率为1 cm-12 cm-1，信号采集的曝光时间为20s。测量样品之前，用硅片特征峰520.7 cm-1 校准仪器。测量参数为每组样品取20 个细胞测量，对每个细胞上选取5 个采样点各进行3 次测量取平均以消除随机误差，测量所得的样品拉曼谱先除去玻片的背景谱，再进行基线处理，取平均谱。,实验结果：图 为不同pH 值下鳄鱼红细胞的拉曼谱（由于pH=2.55 以及pH=10.0 的样品没有得到信号，故只给出8 组样品图谱），在8 个pH 条件环境下鳄鱼红细胞都有拉曼信号，并且都出现了波数在754cm-1，1544cm-1，1582cm-1，1604cm-1 和1617cm-1 的红细胞拉曼谱特征峰，并且可以看出不同的pH 条件下得到的谱图是有差异的。,讨论：从所获得的实验数据可知，在酸性pH=2.55、碱性pH=10.0 时红细胞无拉曼谱信号，此种情况视为鳄鱼红细胞完全失去携氧能力。换言之，其血红蛋白在pH=2.55pH=10 间仍有携氧能力，且其血红蛋白抗酸能力比抗碱能力强。在红细胞拉曼光谱中，1639 cm-1 波数的谱峰表征细胞中的血红蛋白处于氧合态，1610 cm-1 波数的谱峰表征细胞中的血红蛋白处于去氧态。从拉曼谱中可以看出这些细胞均处于氧合与非氧合的混合态，即细胞内同时存在氧合血红蛋白和非氧合血红蛋白,通过计算I（1639/(1610+1639)）可以得出氧合血红蛋白占总蛋白数的百分比，以此反映其血红蛋白氧合能力的大小（如图2 所示），在pH=7.13 和pH=7.82 时，氧合血红蛋白数占总蛋白比例最高，而随着pH 增大或减小，氧合蛋白比例均会减小。由于红细胞中氧合血红蛋白的数量直接影响红细胞的携氧能力，因此图2 反映的也是鳄鱼红细胞携氧能力随外界pH 值的变化趋势。另外，从拉曼图谱上我们可以看出，当外界pH6.58 的时候，红细胞拉曼谱上波数为1639 cm-1 和1610 cm-1 的峰强度减弱，另外会出现一个波数为1620 cm-1 的峰。如前述，在拉曼谱中1639 cm-1 表征的是氧合血红蛋白的特征峰，而1620 cm-1 表征的是高铁血红蛋白的特征峰，其不具备携氧能力。出现这两个峰差异的原因可能是在正常pH 环境下鳄鱼红细胞只需要一部分的血红蛋白来完成携氧功能，而一部分红细胞中的血红蛋白被三价铁离子保护形成高铁血红蛋白,结论：1、鳄鱼红细胞血红蛋白在pH=3.02pH=8.80 均能保持正常的生理活性 2、鳄鱼红细胞中氧合蛋白占总蛋白百分比pH=7.13 和pH=7.80 条件下最高，随着pH 的升高或降低，红细胞中氧合蛋白占总血红蛋白的总量百分比均下降；3、鳄鱼红细胞通过调节携氧血红蛋白比例来适应不同pH 值条件下的携氧需求。在正常pH 条件下无需所有血红蛋白即可完成携氧功能，而在酸性条件下可以使用全部血红蛋白完成携氧功能 4、鳄鱼红细胞抗酸性能力比抗碱性能力强，这与我们之前研究吻合,Thank you!,