《fx基因工程》PPT课件.ppt

Genetic Engineering,基因工程指按照，进行，并通过和等技术，赋予生物以，从而创造出更符合人们需要的和。又叫。,人们的愿望,严格的设计,体外DNA重组,转基因,新的遗传特性,新的生物类型,生物产品,DNA重组技术,【必修II】基因工程又叫或。通俗地说，就是按照，把一种生物的某种 提取出来，加以，然后放到另一种生物的 里，定向地改造生物的。,基因拼接技术,DNA重组技术,人的意愿,基因,修饰改造,细胞,遗传性状,基因工程的探索之路,1、基础理论的突破：（1）的证明1944，艾弗里，肺炎双球菌的转化实验（2）的确立1953，沃森和克里克，DNA双螺旋结构模型（3）的破译1963，尼伦伯格和马太，破译编码氨基酸的遗传密码,DNA是遗传物质,DNA双螺旋结构和中心法则,遗传密码,2、技术发明使其实施成为可能：（1）的发现1967，罗思和海林斯基，质粒能自我复制并可转移（2）的发明1970，阿尔伯、内森斯和史密斯，第一个限制性内切酶（3）技术的发明1965，桑格，氨基酸序列分析技术；1977，DNA序列分析（4）的实现1972，伯格，构建第一个体外重组DNA分子（5）实验的成功1973，博耶和科恩，质粒和DNA片段重组（6）动物问世1980，第一个转基因小鼠（7）技术的发明1988，穆里斯,基因工程的探索之路,基因转移载体,工具酶,DNA合成和测序,DNA体外重组,重组DNA表达,第一例转基因,PCR,基因工程的探索之路,1、基础理论的突破：（1）的证明（2）的确立（3）的破译,DNA是遗传物质,DNA双螺旋结构和中心法则,遗传密码,2、技术发明使其实施成为可能：（1）的发现（2）的发明（3）技术的发明（4）的实现（5）实验的成功（6）动物问世（7）技术的发明,基因转移载体,工具酶,DNA合成和测序,DNA体外重组,重组DNA表达,第一例转基因,PCR,必修II：,运载体,DNA连接酶,选修：,(限制性核酸内切酶),11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）,分子手术刀分子缝合针分子运输车,限制酶,基因的剪刀基因的针线基因的运输工具,11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）,1、限制性核酸内切酶（限制酶）,（1）主要从 中分离纯化出来。（2）能识别，大多数的识别序列有 个核苷酸（48）。（3）切割。,原核生物,双链DNA的特定核苷酸序列,6,（两个核苷酸之间的）磷酸二酯键,EcoRI限制酶,形成2个“黏性末端”（反向互补）。,1、限制性核酸内切酶,EcoR,黏性末端,1、限制性核酸内切酶,平末端,Sma,限制酶的作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,回文结构(palindrome),3，5-磷酸二酯键,特点：,11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）,1、限制性核酸内切酶（限制酶）,（1）主要从 中分离纯化出来。（2）能识别，大多数的识别序列有 个核苷酸（48）。（3）切割。,原核生物,双链DNA的特定核苷酸序列,6,（两个核苷酸之间的）磷酸二酯键,1、限制性（特异性）2、回文序列3、平末端和黏性末端,特定核苷酸序列,特定位点,一种序列或位点,11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）,2、DNA连接酶,（1）连接部位：,（2）结果：形成,(两个核苷酸)脱氧核糖和磷酸之间,磷酸二酯键,2、DNA连接酶,E.coli DNA连接酶T4 DNA连接酶,黏性末端,黏性末端、平末端,来源连接的末端,大肠杆菌,T4噬菌体,11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）,2、DNA连接酶,（1）连接部位：,（2）结果：形成,(两个核苷酸)脱氧核糖和磷酸之间,磷酸二酯键,（3）结果：DNA连接酶和DNA聚合酶的比较,DNA聚合酶：单个核苷酸加到已有核酸片段的3末端的羟基上。以一条DNA链为模板通过磷酸二酯键形成互补链。,DNA连接酶：两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。将DNA双链上的两个缺口同时连接，不需要模板。,差别：,相同：,1、连接部位2、有无模板链,1、磷酸二酯键2、蛋白质,11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）,2、DNA连接酶,（1）连接部位：,（2）结果：形成,(两个核苷酸)脱氧核糖和磷酸之间,磷酸二酯键,（3）结果：DNA连接酶和DNA聚合酶的比较,单个的核苷酸,两条DNA片段,DNA模板,模板,都形成磷酸二酯键,都是蛋白质,11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）,3、运载体,（1）作用：将导入；利用其复制可使目的基因在受体细胞内。,（2）特点：（运载体必备的条件）能在宿主细胞内并；具有多个，便于外源基因连接；具有某些，便于进行筛选。安全分子大小适宜,（3）常用：,目的基因,受体细胞,大量复制,自我复制,稳定保存,限制酶切割位点(切点),标记基因,质粒、噬菌体、动植物病毒。,质粒：存在于细菌及酵母菌（细胞质）中，独立于染色体而自主复制的环状双链DNA分子。最常用的运载体（尤其是大肠杆菌质粒）。,裸露、结构简单、独立，自我复制、双链环状，DNA分子,12基因工程的基本操作程序（基因工程的操作步骤）,必修II：,选修：,1、提取目的基因2、与运载体结合3、导入受体细胞4、目的基因表达与检测,1、获取目的基因2、构建表达载体3、导入受体细胞4、目的基因检测与鉴定,1、提取目的基因的方法：,直接分离基因鸟枪法,缺点：盲目性大，工作量大，成功率低。,人工合成基因法,逆转录法：mRNA单链DNA双链DNA直接合成法：蛋白质的氨基酸顺序mRNA核苷酸顺序基因的脱氧核苷酸顺序目的基因,限制酶载入供体细胞DNA许多DNA片段运载体导入DNA扩增表达分离受体细胞产生特定性状目的基因,目前较广泛使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等,目的基因获取方法,第一步：获取目的基因,（编码蛋白质的结构基因）,含有所需要的完整的遗传信息的DNA片段。,1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增,12基因工程的基本操作程序,基因文库(gene library or gene bank)：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在。（人工构建）根据构建方法的不同，基因文库分为：,基因库(gene pool)：特定生物体全基因组的集合。（天然存在）,基因组文库（包含一种生物所有的基因）cDNA文库（只含部分基因),1、从基因文库中获取,基因组文库,cDNA文库,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,克隆载体:为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。表达载体:为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。,(1)从基因组文库获取目的基因,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组DNA分子,cDNA文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,(2)从cDNA文库获取目的基因,2、利用PCR技术扩增,(聚合酶链式反应),变性,复性(退火),延伸,氢键打开，形成模板链,引物与DNA互补配对,DNA聚合酶作用使引物延伸,1,2,3,4,脱氧核苷酸,DNA聚合酶,引物：人工合成的,与模板DNA上所要扩增的DNA片段的两侧序列互补，长度为20-25碱基的寡核苷酸单链。,1、PCR技术的原理,缓冲溶液,DNA复制原理,DNA热变性原理,2、条件,模板双链DNA分子(目的基因),原料游离的4种脱氧核苷酸,酶Taq DNA聚合酶,2种引物（RNA）人工合成，与要扩增的DNA片段两侧序列互补，引导DNA子链形成。,高温供能变性解旋,（1）变性（2）复性（3）延伸,3、过程,90，第一次10min，最后一次1min,50，30sec,在DNA聚合酶作用下配对延伸子链,(目的基因)DNA受热变性解旋,引物分别与两条DNA单链互补配对,72，1min,4、特点：1、体外复制；2、大量获取目的基因（指数式增长）；3、原理和操作简单。,3、化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,根据蛋白质的氨基酸顺序推算出mRNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。,DNA合成仪,基因的结构（原核细胞）,非编码区：不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。,编码区：能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质。,内含子:不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA。,外显子:能够编码蛋白质的序列。,基因的结构（真核细胞）,真核细胞和原核细胞的基因结构比较,1）相同点：,2）不同点：,原核的编码区是连续的，而真核的是间隔不连续的。,都是由编码区（编码蛋白质）和非编码区（调控作用）组成。,2、目的基因与运载体结合构建表达载体,DNA,质粒,重组质粒（表达载体）,DNA连接酶,同种限制酶处理,第二步：基因表达载体的构建,（使目的基因能稳定遗传、表达发挥作用）,启动子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。,终止子：使转录停止。,标记基因：鉴定受体细胞是否含有目的基因，进行细胞筛选。,是指已知功能或已知座位的基因。在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因；在基因定位中是指定位在染色体或其它载体上的基因以作为其它基因定位的标记。,12基因工程的基本操作程序,体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。,3、将目的基因导入受体细胞,借鉴了细菌或病毒侵染细胞的方法。,受体细胞（如，细菌）,细胞壁通透性增大,第三步：导入受体细胞,导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（将质粒或其他外源 DNA 导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。）,感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组 DNA 分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，感染适当的细胞并在细胞内扩增。,转染：真核细胞主动摄取或被动导入外源 DNA 片段而获得新的表型的过程。,12基因工程的基本操作程序,转化的方法：,导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞,受体细胞应具备的条件,1、限制性缺陷型（外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）2、重组整合缺陷型（用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）3、具有较高的转化效率4、具有与载体选择标记互补的表型5、感染寄生缺陷型（防止重组细菌扩散污染，生物武器除外）,1）导入植物细胞,农杆菌转化法,特点：易感染双子叶植物和裸子植物,可把Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上.,2)导入动物细胞,显微注射技术,用口径为1 m的DNA注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。,原核生物的特点:繁殖快、单细胞、遗传物质少,2)导入微生物细胞,大肠杆菌转化过程,将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,4、目的基因的检测和表达,(1)细菌的检测：将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,4、目的基因的检测和表达,(2)多细胞生物的检测：将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达出相应的性状。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达；如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,4、目的基因的检测和表达,检测：根据受体细胞是否具有标记基因。,表达：受体细胞表现出特定的性状。,第四步：目的基因的检测与鉴定,DNA分子杂交技术,12基因工程的基本操作程序,探针(probe)：一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,标记物同位素标记：32P非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等,1、检测转基因生物的染色体DNA上的目的基因2、检测目的基因是否转录mRNA3、检测目的基因是否翻译蛋白质,检测,鉴定,个体生物学水平鉴定（如抗虫、抗病鉴定，基因工程产品与天然产品功能进行活性比较等）,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,克隆(clone)通过无性繁殖获得来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。而获取此同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)。,DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆个体克隆（动物或植物）,DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。,Transform,+report gene substrates,基因工程成果及发展前景,1、医药卫生2、农、牧业及食品工业3、环境保护,基因工程药品的生产基因诊断基因治疗,培育转基因作物培育转基因动物开发新食品来源,环境监测环境净化,基因工程药品的生产,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,1、医药卫生,胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!,我国生产的部分基因工程疫苗和药物,人工合成胰岛素,从人血中提取干扰素，300L血才提取1mg！通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取204mg干扰素。,人工合成干扰素,人造血液及其生产,重组DNA医药产品,基因诊断与基因治疗,运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。,通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。,1、医药卫生,生物芯片,从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,基因芯片扫描仪,芯片数据处理,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯,不会引起过敏的转基因大豆,2、农、牧业及食品工业,生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国),乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),乳铁蛋白转基因山羊,携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛,3、环境保护,1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来,培育“指示生物”,用基因工程培育“超级细菌”分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,基因工程成果及发展前景,1、医药卫生2、农、牧业及食品工业3、环境保护,基因工程药品的生产基因诊断基因治疗,：胰岛素、干扰素、疫苗,：用基因探针检测肝类病毒，诊断遗传病,：把健康外源基因导入有基因缺陷的细胞中,培育转基因作物培育转基因动物开发新食品来源,环境监测环境净化,：具优良品质农作物，具抗逆性新品种。如高产稳产、抗虫棉、耐贮存番茄，抗除草剂玉米。,：人们所需具优良品质的动物，乳房发生器。如转基因奶牛、超级绵羊。,：生产转基因超级细菌（分解四种烃类的“超级菌”，吞噬汞和降解土壤中DDT的细菌）。,单细胞蛋白,：利用DNA探针检测水中细菌或病毒的含量。,转基因生物和转基因食品的安全性,转基因生物的优缺点：优点可实现人类对基因的定向转移，有利研究生物制药等。缺点可能带来生态灾难或战争狂人的“基因武器”。,转基因生物和转基因食品的安全性,对转基因食品无害性的评估主要有以下几方面：是否有毒性、引起过敏反应、营养或毒性蛋白质的特性、注入基因的稳定性、基因改变引起的营养效果及其他不必要的功能等。对人类健康而言，我们主要应审查转基因食品有无毒性及对环境的影响。,欧盟对转基因食品的生产和销售制定了一系列法规，要求基因改变不得超过基因总量的1，市场上出售的转基因食品必须贴标签。,转基因食品的安全性要求：,