《高效液相色谱分析》PPT课件.ppt

复习,2023/8/3,分离度R定义；为什么可用分离度R作为色谱柱的总分离效能指标？能否根据理论塔板数来判断分离的可能性？为什么？根据“相似相容”原理，色谱的流出规律？热导检测器适用范围与工作原理？,色谱流出规律,分离非极性物质，一般选用非极性固定液，各组分按沸点次序先后流出色谱柱，沸点低的先出峰，沸点高的后出峰。分离极性物质，选用极性固定液，各组分按极性顺序分离，极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱。分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液，这时非极性组分先出峰。对于形成氢键的试样，如醇、酚、胺和水等，一般选用极性或氢键型固定液，各组分按与固定液分子间形成氢键能力大小先后出峰。,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,第三章高效液相色谱分析法,一、高效液相色谱法特点Characteristic of HPLC二、影响色谱峰扩展及分离的因素The factors that influence peak expansion and sepration,high performance liquid chromatograph,3-1概述,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,经典LC与HPLC比较,2023/8/3,HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器,HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便,2023/8/3,GC与HPLC的比较,2023/8/3,与GC比较，HPLC的优点,分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行,2023/8/3,缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。,与GC相比，流动相差别,GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,2023/8/3,2023/8/3,影响色谱峰扩展及分离的因素,基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因子)、塔板理论及速率理论。由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。,2023/8/3,速率理论(与GC对比),GC:HPLC:,2023/8/3,速率理论(与GC对比),讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next2）涡流扩散项及其影响 next,2023/8/3,速率理论(与GC对比),2023/8/3,速率理论(与GC对比),3）传质阻抗项及其影响,2023/8/3,HPLC法中分离条件的选择,1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3.柱温的选择：选室温250C左右,2023/8/3,2023/8/3,第三章高效液相色谱分析法,一、液-液分配色谱liquid-liquid partition chromatograph二、液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph五、离子对色谱ion-pair chromatograph四、离子色谱ion chromatograph六、排阻色谱size-exclusion chromatograph,3-2主要分离类型与原理,high performance liquid chromatograph,basic principle and main separating types,2023/8/3,一、液-液分配色谱liquid-liquid partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。,2023/8/3,二、液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,2023/8/3,三、离子交换色谱ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3-Na+M+=RSO3-M+Na+阴离子交换：RNR4+Cl-+X-=RNR4+X-+Cl-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,2023/8/3,四、离子对色谱ion pair chromatography,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。,2023/8/3,五、离子色谱ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一项技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。,传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。,2023/8/3,1、离子色谱法原理,离子交换原理，与传统离子交换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；,低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。,2023/8/3,2、离子色谱优点,（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；,（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。,（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱,2023/8/3,3、离子色谱装置类型 suppressed apparatus of IC,抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂。,非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。,2023/8/3,离子色谱连续抑制装置图,2023/8/3,离子色谱连续抑制原理图,2023/8/3,4、离子色谱的应用 application of IC,阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。,2023/8/3,六、排阻色谱色谱size-exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,2023/8/3,第三章高效液相色谱分析法,一、液相色谱固定相stationary phase of HPLC二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC三、分离条件的选择,3-3 3-4 液相色谱的固定相液相色谱的流动相,high performance liquid chromatograph,stationary phase and mobile phase of HPLC,2023/8/3,一、液相色谱固定相 stationary phases of LC,1.液-液分配及离子对色谱法固定相（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；,（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；,2023/8/3,（3）化学键合固定相,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：SiC d.硅氮键型：SiN,2023/8/3,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；,存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；,2023/8/3,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：510 m；,2023/8/3,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,2023/8/3,4.空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,2023/8/3,二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC,1.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2023/8/3,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,2023/8/3,3.流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),2023/8/3,4.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,第三章高效液相色谱分析法,一、高效液相色谱仪HPLC二、流程及主要部件general process and main assembly of HPLC,3-5高效液相色谱的特点与仪器,high performance liquid chromatograph,feature and instrument of HPLC,2023/8/3,一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph,2023/8/3,液相色谱仪（2）,2023/8/3,液相色谱仪（3）,2023/8/3,液相色谱仪（4）,2023/8/3,二、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,2023/8/3,2.主要部件,(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,(2)梯度淋洗装置,外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,2023/8/3,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,(4)高效分离柱,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,平均颗粒度，颗粒度分布颗粒度(dp)颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布颗粒分布越宽柱效低(渗透性差)颗粒形状球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱的了解（一）,平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布大的孔径可分析高分子量的分子键合相化学影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同可能导致色谱的分离机理不同如：C18、C8、CN,对HPLC柱的了解（二）,含碳量含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好，重现性好有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱C%k苊(50/50的乙腈/水)Symmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolve C-181212.4Ultrasphere ODS1111.3Partisil ODS-31112.0mBondpak C-1810 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5,对HPLC柱的了解(三),填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）,残基处理的效果,NovaPak C18,未封口 C18,抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺,对HPLC柱的了解（四）,硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：k生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小是色谱柱质量好坏的重要标志,对HPLC柱的了解（五）,填料的稳定性硅胶填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2时键合相水解,新一代硅胶基质的色谱柱,Symmetry高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面积：300 m2/g孔体积：1mL/g特点好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长,Waters聚合物基质的反相柱,特殊设计的多孔聚合物胶有很宽的 pH 适应范围（2-12）可用离子抑制方法分析碱性化合物有非常不同的选择性柱效及韧性比相应的硅胶柱低色谱机理不太清楚文献背景低，用户少,色谱柱的规格,内径检测的灵敏度样品的容量长度分离度，理论塔板数速度样品的容量检测的灵敏度,2023/8/3,采用ODS柱为固定相,甲醇-水为流动相,用HPLC分离两种弱碱性药物(pKa=89),但分离效果不理想;主要表现为柱效能低,保留时间过短.试设计通过改变流动相提高分离效能的方案.(10分),2023/8/3,(5)液相色谱检测器,a.紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,2023/8/3,b.光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,2023/8/3,2023/8/3,光电二极管阵列检测器,2023/8/3,c.荧光检测器（fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,2023/8/3,d.示差折光检测器（differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；,2023/8/3,示差折光检测器,2023/8/3,液相色谱常用检测器的一般性质,2023/8/3,一、影响分离的因素factors influenced separation二、分离类型的选择choice of separation types三、液相色谱的应用application of HPLC四、液相制备色谱preparative liquid chromatography五、实际应用过程注意事项,3-6 3-7 3-8影响分离的因素与操作条件的选择,high performance liquid chromatograph,factors influenced separation and choice of operation condition,第三章高效液相色谱分析法,2023/8/3,一、影响分离的因素 factors influenced separation,1.影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,2023/8/3,液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,2023/8/3,2.流速,流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,3.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,2023/8/3,二、分离类型选择 choice of separation types,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,三、HPLC的应用 application of HPLC,1.环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2023/8/3,有机氯农药毒性大、具持久性，正被特异性更高、更易降解的有机磷农药和有机氮农药取代，但其热稳定性差，易在柱上降解。可用高效液相色谱检测。例如，氨基甲酸酯农药是一类应用范围宽，药效高，而对哺乳动物毒性低的农药，随着大量生产和应用，对水环境造成了污染。由于它们热稳定性差，不适于用气相色谱法测定，Anderson等在测定河水中的氨基甲酸酯时，先将样品经过填有反相 C18薄壳型填料的预柱，再进人Altex Ultrasil ODS分析柱，以磷酸一乙酸缓冲溶液和甲醇的混合液为流动相，用高灵敏度的电化学检测器测定，对灭害威、多菌灵等氨基甲酸酯的最低检测质量可达50430pg。,2023/8/3,2.稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,2023/8/3,多环芳烃类不易气化，而在紫外或荧光检测器上有灵敏的响应，可消除或减少无紫外吸收或无荧光信号化合物的干扰，且在反相色谱柱中很好地分离，常用高效液相色谱法测定饮用水、地下水和江、河、湖水中的多环芳烃，用二氯甲烷或环己烷进行萃取，将萃取液经佛罗里硅土或硅胶色谱柱预分离，浓缩后注入ODS柱，用甲醇水或乙睛，水为流动相，分离各种多环芳烃，荧光或紫外分光光度检测器检测。也可将水样经高分子多孔材料如 AmberliteXAD 2、XAD 4、GDX等富集，再适当的溶剂洗脱，浓缩后注入高效液相色谱分析。美国环保局的6440法采用Thk甲烷萃取水中的16种多环芳烃，萃取液经干燥浓缩后，注入反相HC ODS Sil X色谱柱，用乙睛水为流动相进行梯度洗脱，用紫外检测器和荧光检测器鉴别测定。,2023/8/3,3.水中酚类化合物,酚类化合物属有毒有机污染物。水中痕量的酚类化合物易形成氯酚使饮水出现异味。我国水中优先控制污染物黑名单中68种有毒污染物中6种为酚类。高效液相色谱测酚类化合物可保持组成不变，无需衍生可直接测定，对不同取代和不同结构的酚可同时分离分析且重现性好、灵敏度高、选择性好。通常先将水样酸化至pH 4，再经二氯甲烷、氯仿、乙醇等溶剂萃取或通过AmberliteXAD2、XAD4、GDX502、上试401等高分子多孔树脂进行富集，再用乙醇等溶剂洗脱，浓缩后注入反相色谱柱，用甲醇水乙酸为流动相进行梯度洗脱，用紫外检测器或二极管阵列检测器测定。,2023/8/3,4.水中硝基化合物的分析,硝基化合物是制造军火的主要原料，军火的生产和施用引起的硝基化合物对水环境的污染。由于其热不稳定性常用液相色谱法检测。Maskarinec等用高效液相色谱法测定了水中硝胺类、硝基苯类和硝酸酯类炸药。先用Porapak树脂吸附富集水中痕量的硝基化合物，再用丙酮洗脱，浓缩后用乙酸钠一氯乙酸缓冲溶液和丙酮的混合液为流动相，用ZorbaxODS色谱柱分离，用灵敏的电化学检测器定量测定，硝化甘油（NG）和季戊炸药（PETN）的最低检测质量可达0104ng。,2023/8/3,5.水样中无机物的分析,离子色谱可分析阴离子和阳离子。使用电导检测器最低检测质量浓度为几百g/L，使用电化学检测器最低检测质量浓度则可低达几个g/L。一次分析可同时测多种阴离子或阳离子，分析的灵敏度高，所用的样品量小。若用富集柱，可将水样富集可达到很低的检测质量浓度。使用磷酸盐缓冲液为流动相，采用反相高效液相色谱法紫外检测环境水样中的硝酸盐，最低检测浓度可达0.7g/L。一些金属离子可与有机试剂形成螫合物，经反相高效液相色谱法分离后可用分光光度检测器测定。另外，水样中的砷和硒可用高效液相色谱与交流等离子检测器和柱后氢化物发生器联用技术进行分离检测。,2023/8/3,四、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography,获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；,1.色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,2023/8/3,2.液相制备色谱的方法,收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。,2023/8/3,3.制备型液相色谱,制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径2050mm，柱长50cm。,五、实际应用过程注意事项,1.选HPLC参数时的基本考虑溶解度-选择流动相的条件分子量-在样品预处理或GPC分析时有用官能团-有否离子化基团?保留特性如何?样品的基质-考虑如何前处理在基质中样品的含量-分析、制备都考虑检测特性-有否紫外吸收?荧光?找出样品中不同组份之间的差异摸索条件的重要线索,极性问题,2023/8/3,2.对HPLC柱的了解,色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,3.流动相及样品的预处理,液相色谱对流动相的要求除色谱柱对流动相对的要求外，还有与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长,流动相的脱气,流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度脱气机可保持连续脱气，多用于低压梯度,样品的预处理,样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护,样品的预处理重要性,占样品分析时间的比例样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤,样品预处理常用的方法,高速离心过滤、超滤选择性沉淀衍生反应液-固萃取/液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱其他,样品预处理的过程,去除微粒,过滤过滤膜/过滤装置有机(0.5m)/无机(0.45m)膜片可更换一次性使用的膜“Cartridge”使用方便简单，交叉污染小有更小内径，可用于微量样品的处理高速离心大于：10,000g,超滤,机理超滤是一种基于分子量分离的技术目的根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐,选择性沉淀,常用于生化样品中除蛋白有机溶剂乙腈，甲醇强酸三氯乙酸，过氯酸盐50%硫酸铵10%TCA,样品衍生,提高检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性改变组份的基团，如：变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离典型的例子氨基酸分析,样品衍生氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,浓缩样品,浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/Sep-Pak小柱,固相萃取（SPE）技术,固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份固相萃取技术（SPE）的重要性实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上加速样品的制备时间降低样品前处理的成本提高分析的准确性及回收率更容易自动化减少样品处理步骤降低对不稳定样品的影响提高安全性,Waters的Sep-Pak小柱,Waters专门开发了固相萃取技术（SPE）Sep-Pak小柱的应用领域除去杂质及干扰组份把样品分成不同极性的组分析富集微量的组份Sep-Pak小柱的主要种类反相正相离子交换,Sep-Pak的种类,根据Sep-Pak及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用 让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上 让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱,各种Sep-Pek小柱（一）,正相包括Silica/Florisil/NH2/Diol/CN/Alumina可先用6到10倍柱体积的非极性（通常是样品溶液）平衡加入样品用非极性溶剂洗脱不想要的组份用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如NH2/CN确认回收率,各种Sep-Pek小柱（二）,反相包括C18/tC18/C8/tC2/Diol/NH2/CN可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了样品溶解在强一些极性的溶剂中加入样品用强极性溶剂洗脱不想要的组份用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份确认回收率,各种Sep-Pek小柱(三),离子交换包括Accell Plus CM/Accell Plus QMA/NH2可先用6到10倍柱体积的去离子水或弱缓冲液平衡，样品溶解在去离子水或弱缓冲液中加入样品用弱缓冲液洗脱不想要的组份用强一些缓冲液（改变pH或离子强度）洗脱第一组感兴趣的组份用更强的缓冲液洗脱剩下的感兴趣的组份确认回收率,Sep-Pak小柱的方法开发,SPE方法开发的几个关键因素文献查阅Waters有专门Sep-Pak应用资料的数据库（P/N=88286）查阅Waters的网页（）流速控制同色谱理论：以10ml/min润湿小柱，15ml/min加载样品离子交换填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加载样品以15ml/min流速洗脱样品注意样品本底的不同注意载荷量及加样方式,用Sep-Pak C18除去杂质,使极性的杂质先流出中等极性样品流出，保留并分析小柱及其非极性杂质丢弃举例：多肽混合物脱盐小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。把样品载入小柱盐等极性物先流出。用更强(极性更弱)的流动相洗出极性较弱的多肽,用Sep-Pak C18分组分析,样品是一种叫作“Kool-Aid”葡萄饮料的混合物步骤小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。把样品载入小柱糖、有机酸等极性物质先流出。用乙醇/水混合物洗出中等极性的红色染料蓝色染料仍留在柱子内最后用100%乙醇洗出极性最弱的蓝色染料,用Sep-Pak C18富集,在分析前浓缩产物到ppm或ppb级步骤小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。把大量(几百毫升)样品载入小柱溶剂流出被分析的组份仍保留在柱子内最后用少量(几毫升)非极性溶剂洗出极性较弱的要分析的组份,习 题,2023/8/3,1.简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谱带扩张，提高柱效？2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留时间为30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流动相，试指出选用哪中溶剂能减少该组分的保留时间？为什么？3.为了测定邻氨基苯酚中微量杂质苯胺,现有下列固定相:硅胶,ODS键合相,流动相有:水-甲醇,异丙醚-己烷,应选用哪种固定相,流动相?为什么?,习 题,2023/8/3,4.在ODS键合相固定相,甲醇-水为流动相时试判断四种苯并二氮杂苯的出现峰顺序.为什么?,5.在液相色谱中，梯度洗脱最宜于分离(D)A几何异构体；B沸点相近，官能团相同的试样；C沸点相差大的试样；D分配比变化范围宽的试样。,2023/8/3,正确答案：,2023/8/3,1：(C)、2：(B)、3：(C)、4：(D)、5：(B)、6：(A)、7：(C)、,课堂作业1.分析气相色谱和液相色谱的异同点2.用速率理论分析气相色谱和液相色谱的操作条件选择3.在某色谱分析中得到下列数据：保留时间为5.0 min,死时间为1.0 min，固定相体积为2.0 mL,柱出口载气流速为50 mL/min。试计算：(1)分配比；(2)死体积；（3）分配系数；（4）保留体积4.,