《高效液相色法》PPT课件.ppt

六、高效液相色谱法,高效液相色谱法：以高压输出的液体为流动相的色谱技术。,High Performance Liquid Chromatograph,HPLC,高效液相色谱法的特点,1.高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色谱柱液；2.高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离；3.高灵敏度：采用高灵敏度的检测器;4.速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法所需的分析时间较少，一般少于 1h；5.应用范围更广。,HPLC与GC的比较,相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。,不同点：,分析对象,GC：适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品，不适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品。占有机物的20%。,HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，适于溶解后能制成溶液的样品；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品。占有机物的80%以上。,流动相,GC：流动相为惰性气体，如H2、N2、He、Ar；组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。,HPLC：流动相为液体；流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极性、pH值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。流动相种类较多，选择余地广。,GC：加温操作。HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。,操作条件,第一节 高效液相色谱仪,主要部件：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。辅助装置：脱气机、梯度洗脱装置、自动进样装置、数据处理系统。,组成部件,基本流程,一、高压输液系统,包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度洗脱等装置。,1溶剂脱气装置,作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中的N2、O2进入检测器而使噪声剧增。,脱气方式：氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱气等。,2高压泵,作用：输送流动相。无脉动或脉动极小，保证输出的流动相具有恒定的流速。,要求：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等。,作用：分离过程中改变流动相的组成，使所有峰都获得最佳分离效果，分析时间缩短。,基本方式：高压梯度、低压梯度。,2梯度洗脱,高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,低压梯度：一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。如双元梯度、四元梯度等。,二、进样系统,进样方式：隔膜注射器进样 停留进样 阀进样 自动进样器进样,1隔膜注射器进样,色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。优点：装置简单、价廉、死体积小。缺点：是允许进样量小，重复性差，只能用于低压系统(10MPa,压力高了，密封垫会泄漏)。,2停留进样,停止流动相流动后再进样，以防止泄漏，可用于高压。缺点：重新升压后会产生不稳，保留时间和峰形重复性比较差。,3阀进样,结构和作用原理与气相色谱中所用的六通阀相同。优点：进样准确，重复性好，适用于定量分析，更换不同体积的定量管，可调整进样量。,4自动进样,由计算机自动控制定量阀，按预先编制好的程序进行进样。优点：可自动完成几十或上百个样品的分析。在进行大量样品的分析时，使用自动进样器操作可节省大量人力和时间。缺点：装置成本高。,三、色谱柱,组成：包括柱管和固定相两部分。柱管材料通常采用优质不锈钢，柱长一般为540cm，内径为16mm。,色谱柱的两端有烧结不锈钢或多孔聚四氟乙烯过滤片，以防止柱内的填料流出。填充好固定相后的柱子有方向性，在使用时，应使流动相的方向与柱子管外箭头标的方向一致。,四、检测器,1紫外检测器,应用最广：适于约有70的样品。灵敏度高：线性范围大：死体积小：（1mm 10mm，8 L）；对流动相的流速和温度变化不敏感。,分类：固定波长型、可调波长型和二极管阵列检测器。,特点：,固定波长：254 nm或280nm,固定波长紫外检测器,2荧光检测器,工作原理：利用某些试样具有荧光特性进行检测。,特点：高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,3示差折光检测器,工作原理：折光指数与组成有关，连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,特点：通用型检测器；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。,分类：偏转式、反射式和干涉型三种。,偏转式：它是基于折射率随介质中的成分变化而变化，如入射角不变，则光束的偏转角是流动相(介质)中成分变化的函数。因此，测量折射角偏转值的大小，便可得到试样的浓度。,第二节 液相色谱中的固定相和流动相,一、液相色谱固定相,二、液相色谱流动相,一、液相色谱固定相,1按固相材料的刚性程度分类,硅胶：用于液固色谱的固定相，液相色谱的担体，化学键合固定相基质材料。,聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成的多孔颗粒：只应用在离子交换色谱和凝胶色谱中。,2按固相填料的疏松程度分类,薄壳型微珠载体（表面多孔型）,构成：3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶、多孔氧化铝或分子筛等，形成壳形结构。,特点：多孔层厚度小、孔浅、柱效高；分配过程在载体表面进行，出峰快；颗粒大，装柱容易，适于常规分析。,全多孔型载体,构成：硅胶、氟化铝或硅藻土的微粒凝聚而成多孔球体。,特点：颗粒较细，整个微粒全部是多孔性物质，表面积大，负荷量大。适合于复杂混合物分离和痕量分析。,二、液相色谱流动相,（1）称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,1.液相色谱流动相的特性,合适的溶解力与极性。化学稳定性要好，与固定相和被测组分不发生化学反应。与检测器相匹配。溶剂的纯度要高。一般使用色谱纯试剂。溶剂的流动性要好，黏度要低。,2.流动相应满足以下要求,3.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈、水。,第三节 液相色谱法的主要类型,一、液-固吸附色谱二、液-液分配色谱三、离子交换色谱四、离子色谱五、离子对色谱六、排阻色谱,一、液-固吸附色谱,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂；基本原理：组分在固定相吸附剂上吸附与解吸；主要适用范围：相对分子量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾。,二、液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：亲水性固定液疏水性流动相 疏水性固定液亲水性流动相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。,正相色谱固定液极性 流动相极性分离顺序：极性小的组分先出柱；极性大的组分后出柱。分离对象：适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 流动相极性分离顺序：极性大的组分先出柱；极性小的组分后出柱。分离顺序：适于分离非极性组分,三、离子交换色谱,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相酸性水溶液 阳离子离子交换树脂作固定相碱性水溶液基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应，基于组分与离子交换剂之间亲和力的差异进行分离。应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,选择性系数,注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关,以阳离子离子交换为例：RSO3-H+X+RSO3-X+H+,四、离子色谱,传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。,1.离子色谱法原理,离子色谱法：以离子交换树脂为固定相，以电解质溶液为流动相，用于分离阴阳离子。离子色谱中，应用最为广泛的的检测器为电导检测器。为消除流动相中强电解质背景离子对检测器的干扰，常设置一个抑制柱，称为双柱型离子色谱法或化学抑制型离子色谱法。,（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；,（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。,（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱,五、离子对色谱,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。,六、排阻色谱色谱,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,