《非孟德尔式》PPT课件.ppt

第四章非孟德尔式遗传,生物细胞中的遗传物质可以分为两部分，大部分存在于核或核质体中，小部分存在于核或核质体外。与染色体外的遗传物质有关的遗传现象称为染色体外遗传或非孟德尔式遗传。,染色体外的遗传因子,原核微生物(细菌和放线菌)的质粒真核微生物的细胞器DNA（如叶绿体和线粒体）酵母菌的“质粒”类似物等,第一节 原核微生物的质粒,质粒：存在于原核微生物细胞内，染色体以外的主要遗传物质，是能够独立复制的共价、闭合、环状的双链DNA代号:为ccc DNA，covalently closed circle。大小：约为2-100106Dalton，质粒携带有数个到数十个甚至上百个基因。,可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，-严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（1-5）个拷贝；-松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。,质粒性质：,质粒性质：,质粒可以通过转化或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。质粒对于细菌的生存并不是必要的在质粒之间、质粒与染色体之间基因可发生重组。,质粒控制的遗传性状：,控制宿主细胞的致育性；控制对抗生素和重金属的抗性；控制抗生素、细菌素或毒素蛋白的产生；控制特殊高分子有机物质的降解；控制生物固氮作用及对植物的致瘤作用,一、质粒的研究方法和命名原则,（一）质粒的研究方法研究质粒与表型性状的相关性可以采用质粒消除法和转移法.,1 质粒的消除（curing）和转移（transfer）,1）质粒的消除质粒的消除：细菌质粒常因自发或诱发等原因从部分细胞中丢失，并同时失去其控制的表型性状或功能。质粒消除的理化因子：高温、吖啶橙、丝裂霉素C、溴化乙锭和利福平等。,理化因子作用机制：对质粒的复制和分离产生抑制作用；高剂量理化因子会导致DNA突变.例1:吖啶橙对F质粒的消除，在42为100%；例2:原生质体诱导消除质粒:先用溶菌酶处理细菌脱除细胞壁，去除质粒,然后使其细胞再生。该法已经在葡萄球菌、沙门氏菌、枯草杆菌得以应用。,2）质粒的转移,质粒的转移：有些质粒（如F质粒和R质粒）带有转移基因，能通过接合作用向受体菌转移，小质粒（如Col质粒）受基因容量的限制一般没有自我转移能力，可以通过转化、诱动转移或高压电脉冲等特殊手段来进行质粒的转移。,质粒转移的实验：用含有的R质粒(ampr)的大肠杆菌为供体，带有萘丁酮酸抗性基因（nalr）的根瘤菌为受体进行的质粒接合转移试验（图）从含有Amp和Nal的双抗平板上很容易筛选出接受了R质粒的受体菌。,（二）质粒的命名原则:,1)质粒的名称一般应由三个英文字母及其编号组成，第一个字母一律用小p（plasmid）表示，2)后两个字母应大写，可以采用质粒的作者和实验室的英文缩写。,3)三个英文字母后的编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如pBR322、pSC101,pUC18和pUC19等。4)质粒的名称应放在其宿主菌名称后面的括号中，同一菌株含有多个质粒时，每一个质粒均应用各自的括号.如E.coliC600（pBR322）（pXY1234）,5)菌株的原有质粒被消除后,应在其质粒名称的右上角加-”号表示，。E.coliC600：K12(F-)(-)，代表C600是一个消除了F因子和噬菌体的多重缺陷型K12菌株。6)质粒DNA的部分缺失以“”符号表示，质粒中插入其他DNA以“”符号表示，并应在它们之后用括号标明缺失位点或插人的位点及外源基因,pXY9109质粒可写成FtraA3（63.164.0kb），表明它是一个缺失了转移基因A3的F质粒，缺失部位从63.1 到64.0kb。pXY2101可写成pSC101（0kb：k12,hisA，1.5kb），表明pXY2101是在0kb位置上插入了来自大肠杆菌k12菌株l.5kb的hisA基因的pSC101质粒,二、质粒的类型,致育质粒（Fertility plasmid，F质粒）抗性质粒（Resistance plasmid，R质粒）细菌素质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic plasmid）降解质粒共生固氮质粒,1致育质粒,F因子:又称致育因子,大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定细菌性别。,有关内容在讲细菌的接合作用（conjugation）时已介绍,2.抗性质粒(R质粒),抗性质粒：携带抗性基因,使其宿主微生物对抗生素、化学药物或重金属离子等杀菌剂表现出抗性的质粒。自1957年瓦特拉比首次从流行性痢疾志贺氏菌中分离出抗药性R质粒，后来发现抗药性R质粒还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。,带有R质粒的细菌也很少具有性菌毛，只有0.01的细胞才能向受体菌转移。R质粒包括两部分：抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF）和抗性决定因子（r-determinant），,Structure of R Factors(抗性质粒),RTFConjugative plasmidTransfer genes,R determinantResistance genesTransposons,由于抗性基因大多由转座子所携带，很容易在细胞内或细胞间转移.在细胞内的copy数可从1-2个到几十个,分为严紧型和松弛型两种,R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuric ion，mer）四环素（tetracycline，tet）链霉素(Streptomycin,Str)、磺胺(Sulfonamide,Sul)、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)夫西地酸（fusidic acid，fus）,代表性的R100质粒的基因见图,3、细菌素质粒(Col质粒),这类质粒首先发现于大肠杆菌中而得名，该质粒含有编码大肠菌素的基因，-大肠菌素（colicin）是一种细菌蛋白，包括ColEl、ColE2、ColB、ColI和Colv等质粒。只杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响。由G+细菌产生的细菌素通常也是由质粒基因编码，-细菌素（bacteroicin）是细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同亚种或菌株的多肽类代谢产物。例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。,细菌素的抑菌作用,4降解质粒,降解质粒：携带降解酶基因,与微生物降解某些特殊的难分解的有机物质的能力有关的质粒。主要存在于假单胞菌中。降解有机质的种类，CAM（樟脑）、OCT（辛烷）、XYL（二甲苯）、SAL（水杨酸和TOL（甲苯）等。应用：将复杂的农药和化肥降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。资环学院研究农药降解菌.,5 致病性质粒 1）致病性质粒：是宿主微生物对人、动物或植物具有致病性,这些致病菌的致病性是由其所携带的致病性质粒引起的.因为这些质粒具有编码毒素的基因，其产物(毒素)对宿主（动物、植物）造成伤害。,Ti质粒（tumor inducing plasmid）-存在于根癌农杆菌中。能在某些植物根、茎部产生冠瘿瘤，Ri质粒-存在于发根农杆菌中。能在某些植物根、茎部产生毛发状根，Ti质粒分子量为120MD，大小约为200kb，是一个大型质粒。Ti质粒也具有与F质粒相似的自主转移能力，（图）,致病性质粒,根癌农杆菌侵染烟草产生冠瘿瘤,发根农杆菌感染烟草产生发状根,根癌农杆菌,Ti质粒的转移特性,一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,根癌农杆菌侵染烟草和Ti质粒的转移过程,Ti质粒的转移,根癌农杆菌,毒素的基因,2）苏云金芽胞杆菌的毒素蛋白基因大多也是质粒编码的，消除质粒的苏云金芽胞杆菌同时也失去了对昆虫的毒力。,苏云金杆菌含有编码-内毒素(在伴孢晶体中)的质粒，伴孢晶体的结构基因及调节基因位于质粒上。毒素基因已经成功转移到大肠杆菌、假单胞菌中，以及棉花、玉米等植物中。,伴孢晶体,苏云金芽胞杆菌 毒素蛋白基因,6 共生固氮质粒,该质粒存在于根瘤菌中,能控制该菌与相应豆科植物进行共生固氮作用。目前研究较深入的有苜蓿根瘤菌、豌豆根瘤菌(PRL1J1)、三叶草根瘤菌。少数共生固氮质粒还能自主经接合作用向其它根瘤菌或农杆菌转移。多数质粒可以被诱动转移.利用根瘤菌与豆科植物进行共生固氮可以将空气中无机氮转化为有机氮.,7、代谢型质粒,控制微生物的某一特殊代谢过程的质粒。例:沙门氏菌含有乳糖发酵基因，该基因由质粒编码。大肠杆菌含有发酵蔗糖基因，该基因由质粒编码。,三、质粒的大小和数量,质粒的大小常用分子量MD或碱基对数kb来表示。lMD的双链DNA1.66kb。常见质粒大小的范围为1200kb，个别大质粒可达8001000kb。,1、质粒大小测定方法：,1)电泳方法:将纯化的质粒与已知大小的标准DNA(marker)比较；2)也以将提纯的质粒DNA经限制性内切酶分解后，与标准DNA的酶切片段在同一电泳条件下比较计算,marker,质粒,质粒酶切,电泳测定质粒大小,marker,DNA样品,3)可以通过精确测定未知与已知质粒DNA电镜照片上的DNA链长度来推算。,2、质粒的数量：,质粒的数量:指质粒在每一细胞中存在的拷贝数（copy number），与质粒分子量成反比，F因子：1-2个/细胞ColE1：10-100个/细胞,间接法测定质粒的数量：繁殖代数法：采用质粒复制抑制剂（如吖啶橙、溴化乙锭等）或突变株(如温度敏感突变株)使质粒处于不复制的状态下，通过测定开始出现不含质粒供试菌时所经历的分裂代数，即可推算出质粒在原菌株的拷贝数。,TS214中的DNA聚合酶对温度敏感，两种质粒ColDF13-M3和ColDF13都不能在DNA多聚酶发生缺陷的细菌中复制。,对于：3代后出现不带质粒的细菌（不产细菌素），原来约有22个质粒对于：7代后出现不带质粒的细菌（不产细菌素）。原来约有26个质粒 即原来细胞中含有为2n-1个质粒.,四、细菌质粒的转移类型,从转移性来讲，F因子、SCPl等都属于转移性。R因子主要是由于抗药性的转移而被发现的。ColEl是属于非转移性的，ColV2和ColIb属于转移性。在能转移的质粒中，其宿主范围也有差别。例如在假单胞菌属中有两类质粒 P1一类的质粒能在假单胞菌属中进行种间转移，也能转移到大肠杆菌中。个别质粒(例如RP4)能转移到下列各属细菌中大肠杆菌(Escherichia)、变形杆菌(Proteus)、自生固氮菌(Azotobacter)、根瘤菌(Rhizobium)P2一类的质粒的转移范围则不超出假单胞菌一属。革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphlococcusaureus)的质粒pUB110则可以转移到枯草芽孢杆菌中去。,五 不亲和群,1 能并存在同一细菌中的质粒属于不同的不亲和群，不能并存的质粒属于同一不亲和群,fi+表示对致育因子F具有抑制作用。属于fi+类型的R因子当和F因子同处于一个细胞中时，F因子的许多表型效应会遭到抑制，包括细胞接合能力，接受雄性专一噬菌体感染的能力等。fi+类型的R因子在抑制F因子的同时也抑制它自己，一般认为这就是所谓低频转移的原因。所以把对F因子没有抑制作用的质粒称为fi-。,2 fi+和fi-,fi+表示对致育因子F具有抑制作用(fertility inhibition)。所以把对F因子没有抑制作用的质粒称为fi-。属于fi+类型的R因子当和F因子同处于一个细胞中时，F因子的许多表型效应会遭到抑制，包括细胞接合能力，接受雄性专一噬菌体感染的能力，为F专一抗体凝集的能力等。fi+类型的R因子在抑制F因子的同时也抑制它自己，一般认为这就是所谓低频转移的原因。,3大肠杆菌K12为宿主的一些质粒的分群,4、质粒的不亲和性,是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。,质粒不亲和性的原因,质粒不亲和性主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的 由于每一种质粒的复制速率拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。,质粒的相容和不相容性,不亲和群:特性和来源相近的质粒通常属于同一个不亲和群。特性和来源不相近的质粒通常属于不同的不亲和群。相容性：表现为不同质粒在同一宿主细胞内的共存性，能在同一细胞内共存的质粒应属于不同的不亲和群。不相容性：即属于同一不亲和群的质粒（亲缘关系近）不能在同一细胞内共存。,六、质粒的复制,1、质粒的复制类型严紧型复制质粒：质粒复制受到细胞核严格控制，复制与染色体同步，质粒分子量较大但拷贝数较少。如F质粒。松弛型复制质粒：质粒复制不受到细胞核严格控制，复制与染色体不同步，质粒分子量较小但拷贝数较多。如ColE1为代表。,例如在含有氯霉素的培养液中的大肠杆菌停止了分裂，同时也停止了染色体DNA的复制，可是ColEl质粒可持续复制1015h，直到每一个细胞中含有10003000个质粒。,2、质粒的复制受到双重控制的证明,1）通过诱变剂的处理，筛选温度敏感的F-lac+菌株。把经诱变剂处理的lacF-lac+细菌涂在培养基表面；待生长出菌落后影印到两个含乳糖的EMB培养皿上，把一个放在30中培养；把另一个放在42中培养。经过培养以后，选取在30中显示红色而在42中显白色的菌落。这些菌落有两类。第一类在42中呈白色，再把培养皿放回到30中时菌落转变为红色，这是乳糖发酵结构基因的温度敏感突变型。另一类在42中呈白色，再把培养皿放到30中后菌落并不转变为红色，这一类细菌中F-lac的复制呈温度敏感突变状态。在42中F-lac不能复制，因此所有的细菌都成为乳糖不发酵者，这些细菌再在30中培养时菌落都呈白色，因为F-lac已在42培养时由于不能复制而消失。,2）用吖啶橙处理温度敏感的lac+F-lac+细菌，使它成为失去F-lac+的乳糖不发酵细菌lac。-然后使它获得非温度敏感的lacF-lac+细菌的F-lac+质粒，变成lacF-lac+菌株，观察这些细菌的乳糖发酵特性是否为温度敏感性。-如果是温度敏感的，就说明温度敏感这一特性不属于F-lac本身而属于宿主染色体，-如果是不敏感的，则说明在这一温度敏感细菌中这一特性可能属于F-lac本身。,3）使非温度敏感的lacF-细菌获得温度敏感的lacF-lac+细菌的F-lac+质粒而成为乳糖发酵细菌。-这一发酵特性如果是温度敏感的，就说明温度敏感这一特性属F-lac质粒本身。这一质粒称为Fts-lac。否则反之。-上述实验证明除了乳糖发酵结构基因的温度敏感突变型以外，另外还存在着F因子复制的温度敏感突变型，其中一类是由于染色体基因的突变而使F因子的复制呈温度敏感状态，另一类则属于F因子本身的温度敏感突变型。-由此可见F因子的复制受染色体和因子本身的双重控制。,3一个能复制的和一个不能复制的复制子相结合后，复制由前者所控制,1）例1-F因子复制的温度敏感细菌有两种，这两种细菌在42中生长时菌落都呈白色。其中一种是F因子突变的结果，这种细菌可以写作lacFts-lac。-lacFts-lac细菌在42中培养时偶尔出现个别红色的菌落。这些红色菌落中的细菌已经变为Hfr。这说明Fts-lac和染色体相结合，使它的复制由温度敏感变为非温度敏感。-这些Hfr细菌的Fts-lac已和染色体相结合，它的复制为染色体所带动而不受它自己的控制。染色体和Fts-lac这两个复制子已结合成为一个复制子。,1）例2-大肠杆菌突变型dnaA在DNA复制发动方面有缺陷。这一突变型是一个温度敏感的突变型，所以写作dnaAts。带有F-lac+的这一菌株可以写作dnaAtsF-lac+。-这一菌株不能在42中生长，因为它的染色体不能在42中复制。-选取个别能在42中出现的菌落，发现这些菌落中的细菌也变成了Hfr细菌。-在这些细菌中染色体DNA复制的发动已为F因子所控制，或者说突变基因dnaAts已为整合到染色体上的F因子所抑制。,3一个能复制的和一个不能复制的复制子相结合后，复制由前者所控制,4 两个都能进行复制的复制子结合后，复制又由谁控制呢？,pSCl01和ColEl是大肠杆菌的两种质粒。pSCl01和ColEl结合起来的质粒称为pSCl34。,在具有正常的DNA聚合酶I的细菌(CR34polAl+和C600polAl+)中，pSCl01可进行正常的复制，每一细胞中可产生相当于每一染色体的pSCl01质粒5个，它所带有的四环素抗药性因子使宿主细胞所呈现的抗药性为25-30单位ml。,ColEl和pSC101能够并存在同一细胞中，作为属于不同的不亲和群的两个质粒，它们的复制彼此不相干扰，每一细胞的质粒数是两者之和。只有pSCl01带有四环素抗性基因，所以带有这两种质粒的细菌的抗药性并不因为质粒的总数的增加而提高。,pSCl34在有或没有正常的DNA聚合酶的宿主中的行为不同。在DNA聚合酶I发生缺陷的宿主W3110polAl-)中它的行为不论从质粒数、抗药性和电子显微镜下观察到的复制开始部位来看都和pSCl01相同，但是在DNA聚合酶正常的宿主细菌中这些行为则都和ColEl相同。在pSCl34中pSCl01的复制为ColEl所带动，所以它的16个质粒上都带有抗性基因，因而宿主细菌的抗药性也大大地提高了。,七、质粒的稳定性,1、质粒遗传的稳定性：质粒应在细胞分裂前复制，然后均等地分配到子代细胞中，从而实现质粒遗传的稳定性。,2、某些质粒（F、Rl和pSC101）中发现有par基因，参与质粒在细胞分裂时的分配作用。Par称分配区。3、不同类型质粒间的par基因在功能上可以互补，如丢失了par基因的R1质粒，可因获得了来自pSC101的par基因，实现质粒在分配上的稳定性。,4、没有par基因的高拷贝质粒ColE1依赖于质粒的随机分配来实现细胞分裂过程中的稳定性。5、在某些情况下，ColE1能彼此重组而形成多聚体（multirner），使单个细胞内质粒的拷贝数减少，增加无质粒子细胞的产生。,没有par基因的质粒的随机分配,无质粒子细胞,6、ColE1质粒上有cer基因专门负责多聚体的解聚作用，能使之重新转变为单体质粒。7、某些质粒还通过在无质粒细胞中编码产生特殊的致死蛋白（杀死无质粒子细胞）来保证质粒的稳定性。8、一般含有质粒的细胞的生长速度低于无质粒细胞，在相同条件下混合培养时，含质粒细胞所占的比例将逐渐下降.,八、质粒的转移,1、质粒根据其转移性可分为转移性和非转移性两大类型。转移性质粒大肠杆菌的F质粒、Rl、R100、Co1V、ColIbR6K、RP4天蓝色链霉菌pSCP1、豌豆根瘤菌pJ5JI等。转移性质粒多是低拷贝的大质粒.非转移性质粒多是多拷贝的小质粒,大多数细菌素质粒.,2 质粒的转移受到限制修饰系统的影响,转移性质粒在同一种细菌间转移时不为限制酶所分解，因为它必然已经被修饰，如果由一种细菌转移到另一种细菌则常受限制。没有限制作用的宿主细菌如大肠杆菌C容易接受噬菌体的感染，也容易接受质粒的转移。限制缺陷型(restrictionless，r)宿主可由原来不易接受质粒转移的状态变为容易接受转移的状态。,3、质粒的转移,1)自主转移质粒转移从oriT(DNA转移起始位点)开始。在转移的同时进行复制。F质粒转移只能在相同或相近的供、受体菌细胞之间进行。许多R质粒由于含有转移操纵子和抗性基因，能在较广的宿主范围内转移。,2)诱动转移,诱动转移：ColE1和RSF1010等小质粒由于缺少转移基因而不能自主转移，但由于它们含有bom位点（与F质粒的oriT类似）或诱动基因mob,因而能够被带有tra基因的转移质粒如F质粒等诱动转移.,例:以同时含有F和ColE1质粒的Ecoli为供体菌，对F-菌株进行接合转移试验.90以上获得ColE1质粒的受体菌为F+，5以上获得ColE1质粒的受体菌为F-，诱动转移不一定需要F质粒共转移。,诱动转移过程：,非转移性质粒在松弛蛋白（诱动基因mob编码）作用下解旋开始核酸内切酶在bom位点处将质粒一条单链切成开链环状。松弛蛋白在单链切口5-端结合作为引导蛋白。在F质粒转移基因traJ产物(转移因子)的帮助下，经接合作用过程诱动转移到受体菌细胞内。,F traJ产物(转移因子),松弛蛋白（诱动基因mob编码）,bom（与F质粒的oriT类似）,一 转座因子类别,第二节 转座因子,除了与转座行为有关的基因以外不带有任何其他基因的最简单的转座因子，即插入序列(insemon sequence，IS)，除了与转座有关的基因以外还带有其他基因的转座因子，即转座子(transposOn，Tn)，某些具有转座功能的温和噬菌体如大肠杆菌的Mu噬菌体。,1 插入序列(IS),插入序列:是一段kb的序列，含与转座相关的基因，存在于染色体、质粒或噬菌体上,多拷贝。,2 复合转座元（composite transposon）,复合转座元：除含有与自身转座相关基因,还含有其他基因。,1）结构:线形DNA分子，37kb.不含IR 序列，游离MuDNA两端各接一段寄主DNA,整合状态时会消失。2）MuDNA左端含有与转座有关的A基因和B基因，分别编码分子量为70kb和33 kb的两种蛋白。C基因编码的产物对A基因和B基因表达有调节作用右端含有G片段。,3 Mu噬菌体,二 转座子按转座行为可以分为下列几类,1 保守型转座子：转座过程中将转座子转移到别的位置以后，原来位置上的转座子便不再存在，所以它也称为非复制型转座子。2 复制型转座子 转移到另一位置后原来位置上的转座子并不消失，所以实际上在这一过程中是由原来位置上的转座子又复制了一份到另一位置上。3 切离型转座子：在转座过程中首先使转座子从原来位置上切离，然后切离下来的转座子 整合到所转移到的位置上。4 反转录转座子：在转座过程中首先通过反转录,形成转座子的RNA拷贝，然后这一mRNA的中央部分，即内含子(intron)剪接到另一位置上。接受转座子的位置上或是一个双链，或是一个单链。最后通过互补DNA(compleInentary DNAcDNA)的合成、重组、解离等过程而完成转座过程,I 保守型和复制型,共同的结构特征是两端的反向重复序。由于两端的反向重复序列的存在，一个带有某一转座子的质粒 经热变性并复性后，在电子显微镜下可以看到一个茎一环结构,三 转座子的一般结构,四 转座机制,各类转座子有各自的独特的转座机制。以复制型转座子Tn3为例，说明转座子的转座机制。Tn3具有一个氨苄青霉素抗性基因，它位于两个IR序列的中间。,（一）Tn3结构,Tn3全长4957bp，两端各有38bpIR。Tn3有三个结构基因：tnpA基因、tnpR基因和amprtnpA基因：编码转座酶（识别和切割给体转座元两侧和受体靶序列两侧各一单链）,tnpR基因：编码的蛋白质具有拆分酶活性（共和体拆分）tnpA和 tnpR基因转录方向相反。res位点处于tnpA和tnpR基因调控区内。包括三个结合位点tnpR蛋白质通过与res位点结合而行使拆分酶功能的。,（二）测验过程,1 首先取得Tn3转移到ColEl的衍生质粒pMB8上后所形成的质粒RSFl050。RSFl050经离体诱变处理后得到了一系列缺失突变型。,根据它们的表型可以分为三类：,1）氨苄青霉素抗性消失而转座功能不变(Ap)；是氨苄青霉素抗性基因部分缺失的结果，2）抗性不变而转座功能丧失；3）抗性不变而转座功能增强1 050倍。后两类的功能通过下列互补测验鉴定。,2 互补测验,把两个缺失突变型质粒引入到同一带有具有带动转移功能的F-KmR的recA大肠杆菌中(由于重组基因突变recA的存在，可以判断下述ApRKmR细菌的出现是由于转座而并非由于重组)。然后，用一个对氨苄青霉素和卡那霉素都呈敏感状态的菌株作为受体，与这一recA菌株在含有两种抗生素并能排斥recA细菌生长的培养基上进行混合培养，选取抗卡那霉素的菌落，测定其中的ApRKmR菌落数（转座功能和ApR要互补）。,Ap与 91、257、276都不能互补。它们的缺失都包括一端的反向重复序(IR)。Ap与529、237、248、511、90都能互补，,3 区域内部的突变型的互补,为了进行这一小区域中的互补测验，用的不是缺失而是点突变。每一个点突变都由一个8一核苷酸片段的插入所造成。点突变可以通过互补测验分为三个区域：每一个区域内的突变型都不能互补，不同区域间的突变型都能互补。使转座功能下降的突变型都属于转座酶(transposase，TnpA)基因。上面所讲的使转座功能提高(o-50倍)的突变型属于调控区。,五 Tn3转座模型,质粒pBR322上有两个抗药性基因：氨苄青霉素抗性基因 和四环素抗性基因，在ampr附近有一个复制起点(ori)。取得能接受 596转座子的质粒DNA上的两个Tn3之 间称为解离位点(res)的DNA片段，把它接在pBR322的两个相对位置上，其中一个位置在ampr和tetr之间，另一位置在ampr-ori和tetr之间.,含有这一称 为pRR51的复合质粒(而细胞内没有另外的Tn3)的 大肠杆菌对氨苄青霉素和四环素兼具抗性，可是在 细胞内同时含有Tn3和这一pRR51质粒的细菌则不 然，它经过一段时间的培养后变为只对氨苄青霉素 具有抗性。这一现象可以这样解释：含Tn3的细菌细胞存在着基因tnpR所编码的阻遏蛋白，这一阻遏蛋白同时具有解离酶功能，它作用于pRR51的两个解离位点，通过解离酶作用之后出现的带有ampr的片段上有复制起点，因而能复制，但是带有tetr片段上没有复制起点，因而消失。这样，经过一段时间的培养后细菌便由兼抗两种抗生素变为只抗氨苄青霉素 了。,解离酶识别位点是一个回文对称序列 5一TATAA一3 3-AATATT-5当反应系统中不含Mg2+时，解离酶分子附着在 酶解后出现的黏端上，因而酶解得到的是两个线 状分子 5一TTAT AA一3 3-AA TATT一5当反应系统中含有Mg2+时，解离酶分子便脱离 黏端从而出现两个环状分子。,转座模型,1）给体转座元两侧和受体靶序列两侧各一单链产生切口2）二者相连，产生X 结构3）转座元复制形成共和体4）两个转座元发生重组和拆分，重新产生各含一个拷贝转座元的给体和受体DNA.,第三节 真核微生物的核外遗传物质,DNA的分布,（所以说，染色体是DNA的主要载体）,遗传性状受细胞核内遗传物质控制的遗传现象，叫做细胞核遗传（核遗传）。,细胞核遗传,细胞质遗传,遗传性状受细胞质内遗传物质控制的遗传现象，叫做细胞质遗传。,细胞质遗传：由细胞质内的基因决定的遗传现象和遗传规律。母体遗传现象:在细胞质遗传中，子代的遗传性状都与雌性亲本相同，即母体遗传（maternal inheritance）。细胞质遗传为非染色体遗传、非孟德尔遗传、染色体外遗传、核外遗传或母体遗传,例：粗糙脉孢菌中，有一个生长缓慢的突变型P0-(细胞质控制),将突变型P0-的分生孢子（雄性）与野生型PO+的受精丝（雌性）相结合的杂交结果，同野生型PO+分生孢子和突变型P0-的受精丝正常杂交结果完全不同。,母体遗传现象,A:把突变型与野生型进行正交，当突变型的原子囊果与野生型的分生孢子受精结合时，所有子代都是突变型(同母本)。B:把突变型与野生型进行反交，当野生型的原子果与突变型的分生孢子受精结合时，所有子代都是野生型.(同母本),红色面包霉缓慢生长突变型,原子囊果与分生孢子,A,B,对于接合型来说，子囊孢子的接合型仍按4：4分离，说明它是由核基因控制的。如果将生长缓慢的突变型P0-的线粒体分离出来，注射到野生型菌丝中，那么该性状会遗传下去生长缓慢的突变型是由染色体外基因控制的。,Examples of non-Mendelian inheritance:Mutant poky Neurospora possess altered mtDNA cytochrome（细胞色素）that lead to slow growth.poky phenotype is inherited with the cytoplasm.,Fig.15.8,Reciprocal crosses of poky and wild-type Neurospora.,Mating,母体遗传现象,一、酵母菌的线粒体DNA遗传,1、酵母菌小菌落突变 1949年，埃菲露西（Ephrussi）等人用吖啶橙处理野生型酵母获得数种生长缓慢的突变株-形成小菌落；小菌落突变类型：1)分离性小菌落（segregational petite）此种小菌落突变株与野生型菌株杂交产生孢子后，表现出野生型：小菌落=2：2的分离比。,2)中性小菌落（neutral petite）：此种小菌落突变株与野生型菌株杂交产生孢子后表现出野生型：小菌落=4：0的分离比,小菌落突变类型：,3)抑制性小菌落（suppresive petite）：此种小菌落突变株与野生型菌株杂交后，合子立即接种到产子囊培养基上，子囊孢子表现出野生型：小菌落=0：4的分离比。合子进行一定时期分裂，然后接种到产子囊培养基上，子囊孢子表现出野生型：小菌落=4：0的分离比.,2、小菌落突变原因：分离性小菌落：由染色体基因突变产生的，后代产生2:2分离比;中性小菌落：由线粒体基因突变产生的，突变小菌落完全丢失了线粒体DNA(mtDNA);中性小菌落与野生型杂交时,子代mtDNA来自野生型.由于野生型配子细胞质中含有功能正常的线粒体,子代恢复成野生型;抑制性小菌落：由线粒体基因突变产生的，只丢失了部分线粒体DNA(mtDNA缺失突变)。有一些mtDNA片段留下来环化继续复制。,如果缺失突变株mtDNA表达抑制了野生型mtDNA表达，结果子代突变型：野生型=4：0,反之,缺失突变株mtDNA表达没有抑制了野生型mtDNA表达，为突变型：野生型=0：4.,二、叶绿体DNA遗传,菜因衣藻的一种链霉素抗性突变型的配子和野生型配子杂交，所获子代均表现出抗性。这说明这一形状的遗传同样属于染色体外遗传(叶绿体DNA遗传),把接合型为mt+的抗链霉素的Fl菌株（sm-r mt+）和sm-s mt-亲本回交，其子代仍然全部为抗性的（sm-r）把接合型为mt-的抗链霉素的Fl菌株（sm-r mt-）和sm-s mt+亲本回交，其子代仍然全部为敏感的的（sm-s）,菜因衣藻其母体遗传现象显然与粗糙脉孢菌不同（母体遗传），取决于mt+和mt-亲本的某些特征。产生这一现象的原因：是mt+细胞中存在着特殊的限制一修饰酶系统，能特异性地分解来自mt-细胞的DNA（包括抗性基因），但不分解它自身的DNA所致。,第五章 结构基因,比德尔和塔特姆（1941）通过对粗糙脉孢菌营养缺陷型突变性状分析提出“一个基因一种酶”假说.阐明了结构基因的功能和作用。第一节、“一个基因一种酶”假说的验证 1、营养缺陷与遗传代谢性障碍,1）营养缺陷型和基因突变,2）遗传代谢性障碍,分离足够多的营养缺陷型菌株，常常发现引起相同突变的基因并不是等位的。那么几个非等位基因突变产生同一营养缺陷型的现象如何解释?,等位基因:是指在一对同源染色体上，占有相同座位的一对基因(显性基因和隐性基因)，它控制一对相对性状(显性性状和隐性性状)。,以需要某一种氨基酸D的营养缺陷型为例，设想D在细胞中是通过xABCD的一系列反应才合成的。不能进行其中任何一种反应的缺陷型都是D缺陷型。,甲、乙、丙和丁为四种氨基酸D营养缺陷突变型：甲 乙 丙 丁 xABCD,由此可以推测需要同一种氨基酸D的缺陷型是功能上不相同的一系列基因突变的结果。,+,甲 乙 丙 丁 xABCD,引起相同突变的基因可以有多个。,2、互养,1）微生物通过培养基互相提供养料而生长的现象称为互养。2）上述不同氨基酸D缺陷型还可以通过互养实验来区别。将不同的突变型接种到足以使突变型进行少量生长的氨基酸D培养基上。,甲 乙 丙 丁 xABCD,突变型丁：CD不能进行，其后果：一方面需要D，另一方面C积累分泌到培养基中，有益于突变型甲、乙和丙的生长。突变型丙：使突变型乙或甲生长，但不能使突变型丁生长，可是丁能促进丙和乙生长突变型丁和丙：分别促进乙的生长。,通过对营养缺陷型研究，得出以下结论：遗传性代谢障碍是由于基因突变的结果。每一个基因突变造成一个特定的障碍，使一个特定的生化反应不能进行。,3、“一个基因一种酶”假说的初步验证,“一个基因一种酶”假说指出：每一个基因控制一种酶的一级结构，基因突变使酶的一级结构改变，从而使酶的活性丧失。,这一假说验证的关键是证明在突变株中有失活酶的存在。主要实验方法有：免疫血清反应免疫血清反应:一种酶的免疫血清能和该酶蛋白发生沉淀反应使之失去酶活性。,在缺陷型突变株中某一种酶的活性消失了，可是一级结构略有改变的这种酶蛋白，也会与该酶的免疫血清反应而测得它的存在。这种失去酶活性但仍保存了免疫血清学特性的物质称为交叉反应物质（CRM）。,证明失活酶存在的实验过程：,试管滴定法：,用野生型菌株的酶注射家兔，取得它的抗酶抗血清,在突变株酶抽提物中加入抗血清,反应后离心去除沉淀物,在上清液中加入野生型代谢酶,若不产生或只有很少沉淀产生，说明突变株中有与酶蛋白结构相似的CRM。,培养皿测定法：,野生酶,抗酶抗血清,2,3,4,5,6突变型抽提物,如果突变株抽提物中有CRM存在，也会产生相同的沉淀带.,抗血清将在琼脂中扩散,在抗血清和酶接触的地方形成肉眼可见的白色沉淀带,(一)验证,“一个基因一种酶”假说,证明了结构基因的作用,在研究中首先发现：,同一营养缺陷型是由几个非等位基因突变产生的或者：引起相同突变的基因并不是等位的,该假说在研究粗糙脉孢菌营养缺陷型突变中提出的,营养缺陷与遗传代谢性障碍的关系,这一现象通过,来解释,1 营养缺陷与遗传代谢性障碍的关系,xABCD,氨基酸D营养缺陷突变型,甲 乙 丙 丁,氨基酸D由一系列的遗传代谢产生的任何一步遗传代谢性障碍会产生氨基酸D营养缺陷突变型任何一步遗传代谢由基因控制，因此基因突变可导致遗传代谢性障碍在实验中,通过添加中间产物,突变株可以恢复正常生长,同一营养缺陷型是由几个非等位基因突变产生的,营养缺陷与遗传代谢性障碍的关系,这一现象通过,被证实,互养现象,被证实,这一现象通过,2 互养实验,3“一个基因一种酶”假说的验证,假说:每一个基因控制一种酶的一级结构基因突变使酶的一级结构改变，从而使酶的活性丧失。验证假说:证明在突变株中有失活酶的存在验证方法:免疫血清反应,试管滴定法：,用野生型菌株的酶注射家兔，取得它的抗酶抗血清,在突变株酶抽提物中加入抗血清,反应后离心去除沉淀物,在上清液中加入野生型代谢酶,若不产生或只有很少沉淀产生，说明突变株中有与酶蛋白结构相似的CRM。,培养皿测定法：,野生酶,抗酶抗血清,2,3,4,5,6突变型抽提物,也证明了突变株里有失活酶的存在,第二节、顺反子和