[信息与通信]11DNA重组技术的基本工具.ppt

选修3现代生物科技专题,1,据统计，1999年至2006年间，全国累计推广国产转基因抗虫棉1.56亿亩，为国家和农民增收节支400亿元人民币。转基因抗虫棉的产业化缩短了我国农业生物技术与国际先进水平的技术差异，增强了我国农业新兴生物产业的国际竞争力，提升了我国农业科技的国际地位。那么，转基因抗虫棉是利用什么技术培育出来的呢？这项技术需要那些基本工具呢？,专题1 基因工程,3,基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译,4,技术发明使基因工程的实施成为可能1.基因转移载体的发现2.工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现5.重组DNA表达实验的成功6.第一例转基因动物问世7.PCR技术的发明,2023/8/2,5,基因工程的概念：,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,6,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),重组DNA,导入,形成,7,1.1 DNA重组技术的基本工具,2023/8/2,8,山西省孝义市第二中学,基因工程需要哪些基本工具?,9,培育抗虫棉需要哪些工具？,分子手术刀限制性核酸内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车载体,10,一、分子手术刀-限制性核酸内切酶(限制酶）,11,12,T,磷酸二酯键,A,13,14,内切酶切割DNA后形成的末端黏性末端、平末端是如何形成的？,15,什么叫黏性末端？,16,2023/8/2,17,山西省孝义市第二中学,什么叫平末端？,18,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。,19,当限制酶在它识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。,20,限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。图1-1 限制酶识别序列的中心轴线,21,识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的酶。,4000种。,1、来源：,2、种类：,3、作用：,4、结果：,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,22,二、连接酶“分子缝合针”,.作用：连接磷酸二酯键,23,限制酶切割后产生两种不同的末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？,E.coliDNA连接酶：连接黏性末端,T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端,.DNA连接酶的种类,24,DNA连接酶-“分子缝合针”,分类,E.coliDNA连接酶,T4DNA连接酶,差别:E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接;T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。,25,DNA连接酶分子缝合针,26,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？,27,答：不是一回事。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,28,双链,单链,在两DNA片段之间形成磷酸二酯键,将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键,都能形成磷酸二酯键二者都由蛋白质构成,29,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,30,载体的必要条件,能自我复制，或能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达；有一个或多个切割位点有标记基因位点，以便重组后进行筛选对受体细胞无害。大小适中，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,31,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。,32,常用的分子运输车有哪些？,质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒,33,2023/8/2,34,山西省孝义市第二中学,3.基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,35,小结,对受体细胞无害,36,1.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶 B.两种限制酶同种连接酶 D.两种连接酶,A,练习,2023/8/2,37,山西省孝义市第二中学,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,2023/8/2,38,山西省孝义市第二中学,3.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、目的基因的获取 B、基因表达载体的构建 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测与鉴定,C,练习,2023/8/2,39,山西省孝义市第二中学,谢谢,2023/8/2,40,山西省孝义市第二中学,寻根问底:限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,41,怎样理解限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?,42,为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？,1、DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列；2、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能切开。,43,1.原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,2.迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵.,44,问题：标记基因的作用及其应用,标记基因,抗四环素的基因,抗氨苄青霉素的基因,特定颜色的基因,四环素,氨苄青霉素,2023/8/2,45,习题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、写出可能的实验结果，并得出相应的实验结论,2023/8/2,46,载体的三大功能：1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合力。3）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。,理想载体具备四个条件：1)具有对受体细胞的可转移性，提高导入细胞的效率。2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使外源基因在受体细胞中稳定遗传。3)具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的拼接插入。4)具有合适的选择标记（报告基因），便于DNA重组分子的检测。,问题:为什么需要载体,直接将基因导入受体细胞行不行?,2023/8/2,47,质粒的构建与改造1)删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。2)灭活某些质粒的编码基因。3)加入易于识别的选择标记基因。4)加入特殊的基因表达调控元件。,一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运载体进行人工改建。,2023/8/2,48,（08海南高考）右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制酶EcoR、BamH的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR、BamH在内的多种酶的酶切位点。据图回答。（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有、3种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行。（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核受体细胞进行转化实验。之后将这些受体细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核受体细胞所含有的连接产物是；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核受体细胞所含有的连接产物。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶的识别和结合位点是，其合成产物是。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是。,（1）目的基因载体连接物载体载体连接物目的基因目的基因连接物分离纯化（2）载体载体连接物目的基因载体连接物、载体载体连接物（3）启动子mRNA（4）EcoR和BamH,2023/8/2,49,