《重组DNA技术》PPT课件.ppt

重组DNA技术,DNA Recombination Technique,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆个体克隆（动物或植物）,基础理论和技术发展促进了基因工程技术,1基因转移载体的发现2工具酶的发现3DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现5重组DNA表达实验的成功6第一例转基因动物问世7PCR技术的发明,目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,限制性核酸内切酶,定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,限制性核酸内切酶,限制酶的识别序列：,作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类、（基因工程技术中常用型）,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,重组DNA技术中常用的工具酶,（三）目的基因,cDNA(complementary DNA)基因组DNA(genomic DNA),（四）基因载体,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,作为基因工程运载体的条件,能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。载体是安全的，不能对受体细胞有害。载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行操作。,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,目 录,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,二、重组DNA技术基本原理,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,目 录,（一）目的基因的获取,1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,目 录,目 录,（三）外源基因与载体的连接,（二）克隆载体的选择和构建,目 录,受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA导入受体菌,（五）重组体的筛选 1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹 2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。,(插入失活法)抗药性标记选择,目,2.蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。,载体：编码-半乳糖 宿主：编码-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列,-互补,细菌表达：-半乳糖苷酶活性,5-溴-4-氯-3-吲哚（X-gal）形成蓝色菌落,当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。,（IPTG 存在下）,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,原位杂交,Southern印迹,目 录,小结：重组DNA技术操作的主要步骤,五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。克隆基因表达条件：基因的编码区不能被插入序列中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的RNA聚合酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。,1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞,三、重组技术在医学中的应用,（一）疾病基因的发现 1990年美国科学家率先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成；2001年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因；整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。,人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。,制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。,（二）生物制药,动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因把YFG放在乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体内YFG在乳腺中表达乳汁中提纯YFG蛋白。,产品名称 治疗功能与医药范围 1.人胰岛素 治疗糖尿病 2.人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3.干扰素 治疗癌症、病毒感染 4.干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5.干扰素 治疗癌症、病毒感染 6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7.红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8.超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9.凝血因子 治疗A型血友病 10.乙型肝炎疫苗 防治肝炎 11.神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化 12.脑啡肤 镇痛 13.降钙素 治疗骨质疏松症,生产蛋白质和多肽类活性物质,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗(germ line gene therapy),转基因动物研究基因治疗,1.基因检测与产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性分析,（五）遗传疾病的预防,