《醋酸纤维薄膜电泳》PPT课件.ppt

1,实验五,醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质,2,一、目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和 方法二、原理血清中含有多种蛋白质，其等电点均低于pH7.0在pH 8.6的缓冲液中，它们电离出负离子，带正电荷，在电场中向正极移动各种蛋白质的等电点不同，在同一pH值下所带电荷量不同分子的大小不同，因此在电场中的泳动速度不同，这样可将各种血清蛋白质分离开,3,三、实验材料及设备1、样品：新鲜牛血清（无溶血）2、仪器：DYY-2型常压电泳仪、卧式电泳槽3、器材：醋酸纤维薄膜(82cm)；点样器；培养皿；滤纸；直尺、铅笔；镊子；剪刀；和铅笔4、试剂：pH8.6巴比妥-巴比妥钠缓冲液 漂洗液 染色液,4,四、操作步骤1、膜的润湿和选择迎着光辨别无和有光泽面，用镊子将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲液中，自然浸泡30min选择薄膜颜色一致而无白色斑点的膜 2、制作电桥将电泳槽置于平台上，将缓冲液倒入电泳槽内，使两槽缓冲液平衡至同一水平面 于两电极槽各放入2层纱布，一端浸人缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架当纱布全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的纱布以驱赶气泡,5,四、操作步骤3、点样 点样模板的制作 取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸内吸干多余的缓冲液，无光面朝上放在点样模板上在点样器上均匀地沾上血清，将点样器轻轻地印在点样区内 4、电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上，另一端平贴在阳极端支架上连接好电泳仪，接通电源，调节电压为100V，电流为0.6 mA2n，电泳60min,6,四、操作步骤 5、染色与漂洗脱色染色:电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10min漂洗脱色:将膜条从染色液中取出后，移置到漂洗液中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止，可得到色带清晰的电泳图谱五、记录和分析实验结果 把电泳图谱画在实验报告上并指出每条区带的种类,7,六、注意事项1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸 去，吸水量以不干不湿为宜3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免 损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果4、点样应点在薄膜的无光面上，点样量要适量5、电泳时将薄膜的点样端置于负极端，且点样面 向下6、控制染色时间7、过程为防止指纹污染，应戴手套,8,七、思考题 1、电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？2、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？,尿中17-羟皮质类固醇的测定,9,相关知识1、电泳 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，EP)电泳是对混合物中带电离子的分离和鉴定技术2、基本原理电荷的来源：由于本身的解离作用或表面上吸附其它带电质点，在电场中会向一定电极移动 迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度其泳动速度与所分离的物质所带的净电荷的数量、颗粒的大小和形状有关,10,11,3、影响电泳迁移率的因素电场强度溶液pH 溶液的离子强度 温度电渗 支持物,12,电泳的分类,按原理分区带电泳：在电泳过程中，不同离子成分在均一的缓冲液体系分离成独立的区带 移界电泳：是在U型管中进行的电泳 等速电泳：当电泳达到平衡后，各区带相随分出清晰的界面，并以等速移动等点聚焦：由于不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成pH梯度，使被分离物移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带,13,电泳的分类,按有无支持物分 自电泳：在溶液中进行的一种电泳技术区带电泳：有支持物的电泳 纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳圆盘电由泳、平板(垂直、水平)电泳、柱电泳,14,什么是醋酸纤维素薄膜醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成 厚度约以0.1-0.15mm 什么是醋酸纤维素薄膜电泳 以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳,15,醋酸纤维素薄膜电泳的特点吸附作用小，分离效果好 快速省时 灵敏度高，样品用量少应用面广易保存，易定量,16,17,产品名称：双稳定时电泳仪产品型号：DYY-6C型,5-600V 4-400mA 240W,18,卧式电泳槽,醋酸纤维薄膜电泳装置示意图,1、滤纸桥；2、电泳槽；3、醋酸纤维素薄膜；4、电泳槽膜支架；5、电极室中央隔板,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图,（虚线处为点样位置）,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图,1、清蛋白，2、1球蛋白 3、2球蛋白 4、球蛋白 5、球蛋白 6、为点样原点,22,23,24,25,26,点样模板的制作,1.5cm,27,28,优点微量快速简便分离清晰对样品无吸附现象 应用广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面,血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量,30,